[发明专利]一种酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒及应用

说明书

本发明公开了一种酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒及应用，本发明在质粒上将cer基因座插入到含有卡那霉素抗性基因的质粒上，在不加卡那抗生素情况下，在cer作用下，发酵20‑48h后，质粒稳定性维持在60％‑90％，Fn‑TPL体积酶活达到10000‑12000U/L。本发明在含有卡那霉素抗性基因和cer1基因座，在加了卡那霉素情况下，发酵20‑48h后，质粒稳定性维持为100％，Fn‑TPL体积酶活达到12000‑15000U/L。

(一)技术领域

本发明涉及一种酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒及应用。

(二)背景技术

酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol lyase,TPL,E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate,PLP)依赖型酶，催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨。此反应为可逆反应，若以邻苯二酚替代苯酚，该酶可逆向催化生成左旋多巴。TPL催化合成左旋多巴原子经济性高、反应条件温和，环境友好。

为获得高表达量的目标产物，外源基因通常连接于质粒后导入宿主细胞进行表达。本实验室成功构建了组成型具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)TPL(Fn-TPL)大肠杆菌表达体系，利用重组大肠杆菌作为催化剂，催化邻苯二酚、丙酮酸钠和铵一步合成左旋多巴。高密度发酵是获得高重组大肠杆菌生物量和TPL酶活的重要工业手段，一般采用分批补料方式进行，而在发酵过程中，质粒稳定性因素严重影响产酶。一方面，质粒及其表达的蛋白对重组菌生长构成负担，另一方面，当细胞生长进入稳定期后，有害代谢物和目的产物开始积累，对菌体生长产生逆境压力，将激发细胞清除体内外源质粒的胁迫反应，从而导致质粒的减少或者丢失。保持质粒稳定性在发酵生产中具有非常重要的意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒及其在提高酪氨酸酚裂解酶酶活中的应用，将卡纳霉素抗性基因和cer基因座连接到质粒上，以达到提高质粒稳定性的目的，提高E.coli BL21(DE3)宿主细胞质粒稳定性，增加酪氨酸酚裂解酶(Fn-TPL)的产量，不仅有利于重组菌的发酵生产，更可以减少抗生素的使用，减低成本，避免对环境产生污染。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒，所述重组质粒是将卡那霉素抗性基因(KanR)、cer基因与酪氨酸酚裂解酶基因共同导入载体获得的；所述卡那霉素抗性基因(KanR)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述cer基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述载体为组成型表达质粒pET-3a。

进一步，所述酪氨酸酚裂解酶基因Fn-TPL核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

本发明所述酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒按如下方法构建：将酪氨酸酚裂解酶基因Fn-TPL与线性化质粒pET-3a连接，获得质粒pET-3a-Fn-TPL；再将卡那霉素抗性基因(KanR)与线性化质粒pET-3a-Fn-TPL连接，获得质粒pET-3a-KanR-Fn-TPL；最后将cer基因与线性化质粒pET-3a-KanR-Fn-TPL连接，获得重组质粒pET-3a-KanR-cer-Fn-TPL。

本发明还提供一种所述酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒构建的基因工程菌，所述工程菌以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主构建而成。

本发明提供一种所述酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒在提高酪氨酸酚裂解酶产量中的应用，具体所述方法为：(1)将酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒构建的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养15h，获得活化菌体；

(2)挑平板上单菌落接种于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃、180rpm培养8h，作为种子液备用；