[发明专利]一种利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法

权利要求书

1.一种利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法，其特征在于，所采用的步骤如下：

1)包被蛋白：将人纤维蛋白原用包被液稀释，取该人纤维蛋白原溶液于细胞培养板中，将板置于湿盒中，在2-8℃温度下孵育过夜；

2)封闭平板：将步骤1)中的板取出，加入封闭液，在2-8℃温度下孵育；

3)噬菌体库去背景：将噬菌体十二肽库加入新的细胞培养板中，并在摇床平缓摇动；

4)噬菌体结合：吸走步骤2)中培养板的封闭液，反复洗涤3-15次，然后将步骤3)中培养板的液体加入该洗涤后的培养板，在摇床平缓摇动1-4h；

5)洗涤：将步骤4)中培养板的液体吸走，反复洗涤3-15次，得到步骤5)的培养板；

6)洗脱：在步骤5)的培养板中加入洗脱液，室温静置10-30min，然后将液体转移至新的离心管中，加入中和液，得到噬菌体；

7)噬菌体扩增及计数：将步骤6)所得噬菌体进行扩增并计数，稀释至10³-10¹³pfu/mL，得到步骤7)的噬菌体；

8)再重复步骤1)至步骤7)二-五次，在进行重复的过程中，所述的步骤3)中噬菌体十二肽库改为上一轮步骤7)所得的噬菌体；

9)对最后三轮步骤6)所得噬菌体进行测序，统计不同噬菌体出现的频数，出现频数最高的四组噬菌体为筛选所得的噬菌体频数最高的四组展示的多肽为GPRPPSEHLQIT(SED IDNO：1)，LTPHKHHKHLHA(SED ID NO：2)，GPRPPLHLDSMR(SED ID NO：3)，HLHKHHLRSTTH(SED IDNO：4)，

10)对步骤9)所得到的前四组噬菌体进行进一步优选，得到最佳结合噬菌体，筛选所得的噬菌体最优序列为GPRPPSEHLQIT(SED ID NO：1)，该噬菌体展示的多肽为最佳结合多肽。

2.根据权利要求1所述的利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法，其特征在于，步骤1)所包被的蛋白为人纤维蛋白原，由此获得的噬菌体为特异性靶向结合人纤维蛋白原的噬菌体。

3.根据权利要求1或2所述的利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法，其特征在于，筛选所得的噬菌体可以加入凝血材料中，靶向结合人纤维蛋白原，使纤维蛋白原富集，进而促进凝血效果。

4.根据权利要求1所述的利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法，其特征在于，所述的步骤9)中，对所得频数最高的四种噬菌体分别进行扩增纯化稀释，得到10³-10¹³pfu/mL的四种噬菌体溶液，对四种噬菌体进行ELISA实验，得到吸光度最高的噬菌体展示序列为GPRPPSEHLQIT(SED ID NO：1)，证明该噬菌体为靶向结合人纤维蛋白原的最佳噬菌体，多肽序列GPRPPSEHLQIT为最佳结合多肽。

5.根据权利要求1所述的利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法，其特征在于，步骤4)步骤5)所述的洗涤液皆为PBST，步骤6)所述的洗脱液为0.2M Glycine水溶液由HCl调节PH至2.2而成，中和液为50mM Tris水溶液通过HCl调节PH为9.1而成。