[发明专利]一种利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法

说明书

本发明公开了一种利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法，包括包被蛋白、封闭平板、噬菌体库去背景、噬菌体结合等步骤，本发明筛选出的噬菌体对比其余噬菌体，能够特异性结合人纤维蛋白原，且结合力强，易于加工，可以加入各种凝血材料中，通过靶向结合人纤维蛋白原，促使纤维蛋白原的富集，增强凝血效果，具有所用试剂简单易得，成功率高等特点。

技术领域

本发明涉及凝血材料领域，具体地说，是一种利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法。

背景技术

皮肤创伤是生活中最常见的损伤之一，小到日常擦破皮，大到手术甚至战争中受到的大面积创伤导致出血，都需要及时止血，因而凝血功能对于人来说是非常重要的。凝血的过程本质上就是血浆中的可溶性纤维蛋白原变成不可溶的纤维蛋白的过程。当外界材料与血液接触之后，血浆中的蛋白会吸附在材料表面，凝血酶原通过级联反应被激活生成凝血酶，进一步催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，纤维蛋白自发形成纤维网，促进伤口凝血。纤维蛋白原即凝血因子Ⅰ，是血液中含量最高的凝血因子，也是一种急性反应蛋白。在凝血过程中，纤维蛋白原的富集能够有利于伤口处纤维蛋白网络的形成，而能够靶向结合人纤维蛋白原的噬菌体可以通过特异性结合人纤维蛋白原，实现血液中纤维蛋白原的富集。

噬菌体展示技术是通过将肽库与靶蛋白孵育一段时间，洗去未结合的噬菌体，将结合能力强的噬菌体洗脱并扩增后，再在进行下一轮的洗脱，得到与靶蛋白结合能力最强的噬菌体的过程。通过该技术筛选得到的噬菌体特异性好，结合能力强，适合用于筛选靶向人纤维蛋白原的噬菌体的筛选。

发明内容

本发明针对靶向人纤维蛋白原噬菌体领域的空缺，发明利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法，得到能特异性结合人纤维蛋白原的噬菌体。本发明涉及的噬菌体主要用于促凝血领域，能够特异性结合人纤维蛋白原，促进凝血。

本发明公开了一种利用噬菌体抗体库高效筛选纤维蛋白原的方法，所采用的步骤如下：

1)包被蛋白：将人纤维蛋白原用包被液稀释，取该人纤维蛋白原溶液于细胞培养板中，将板置于湿盒中，在2-8℃温度下孵育过夜，该温度范围保证蛋白活力；

2)封闭平板：将步骤1)中的板取出，加入封闭液，在2-8℃温度下孵育；

3)噬菌体库去背景：将噬菌体十二肽库加入新的细胞培养板中，并在摇床平缓摇动；

4)噬菌体结合：吸走步骤2)中培养板的封闭液，反复洗涤3-15次，洗涤次数太少，洗涤不够完全，次数过多，会洗掉结合力强的噬菌体，导致后续步骤的噬菌体过少。然后将步骤3)中培养板的液体加入该洗涤后的培养板，在摇床平缓摇动1-4h，时间太短噬菌体结合不够牢固，时间太长非特异性结合会增多；

5)洗涤：将步骤4)中培养板的液体吸走，反复洗涤3-15次，得到步骤5)的培养板；

6)洗脱：在步骤5)的培养板中加入洗脱液，室温静置10-30min，时间太短洗脱不完全，时间太长噬菌体活力明显下降。然后将液体转移至新的离心管中，加入中和液，得到噬菌体；

7)噬菌体扩增及计数：将步骤6)所得噬菌体进行扩增并计数，稀释至10³-10¹³pfu/mL，浓度太低，筛选得到噬菌体太少无法进行，浓度过高，噬菌体富集度不够，无法得到较好的序列，得到步骤7)的噬菌体；

8)再重复步骤1)至步骤7)二-五次，次数过少，噬菌体富集度不够，筛选效果不佳，次数过多，成本人力增加，不经济。在进行重复的过程中，所述的步骤3)中噬菌体十二肽库改为上一轮步骤7)所得的噬菌体；

9)对最后三轮步骤6)所得噬菌体进行测序，统计不同噬菌体出现的频数，出现频数最高的四组噬菌体为筛选得到的前四组噬菌体；

10)对步骤9)所得到的的前四组噬菌体进行进一步优选，得到最佳结合噬菌体，该噬菌体展示的多肽为最佳结合多肽。