[发明专利]一种β-葡糖苷酶固定化方法及应用

说明书

本发明公开了一种β‑葡糖苷酶固定化方法及应用，利用化学反应将β‑葡糖苷酶固定到聚甲基丙烯酸甲酯树脂上，装入层析柱中，作为大豆异黄酮降解生物反应器，用于连续生产大豆异黄酮苷元。该方法利用具有耐压性能好、孔径大、比表面积大的聚甲基丙烯酸甲酯树脂键合β‑葡糖苷酶，并装柱使用，具有操作方便、酶利用度高、酶活性好、酶寿命长、树脂耐污染、后续分离方便等优点，更重要的是可以进行连续生产，产率高，适合规模化生产大豆异黄酮苷元。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种β-葡糖苷酶固定化方法及应用。

背景技术

大豆异黄酮是大豆中的一种具有生理功能的活性物质。近年来，随着其保健作用研究开发的不断深入，大豆异黄酮的存在形式及生理功能的机理正逐渐被人们认识。研究表明，大豆中的异黄酮存在形式主要是结合型的糖苷，约占大豆中异黄酮含量的95％以上，虽然游离的苷元含量不足5％，但它们表现出来的活性要比结合型的糖苷高得多，为了提高大豆异黄酮的生物活性，提高在人体内的吸收率，将大豆异黄酮进行水解制成大豆异黄酮苷元，这成为近年来大豆异黄酮研究的一个热点。水解原理：大豆异黄酮苷属于氧苷类，是酚羟基与糖缩合而成的β-D葡萄糖苷。通过水解反应使苷键裂解得到大豆异黄酮苷元和葡萄糖配基。水解方法主要有以下几种：

酸水解：大豆异黄酮苷能被酸催化水解，反应在稀醇中进行，用醋酸、硫酸等均可发生水解，从成本和实际应用角度，最常使用盐酸。β-葡萄糖苷键首先发生质子化，然后苷键断裂生成苷元和糖的阳碳离子中间体，再水解，阳碳离子经溶剂化，再脱去氢离子而形成糖分子。酸催化水解的关键是O-苷基的苷质子化程度。但是酸性条件下大豆异黄酮苷元的稳定性值得怀疑。另外，强酸条件下不易进行工业化生产。

碱水解：糖苷键具有缩醛结构，对碱较稳定，但异黄酮中糖苷键具有酯苷性质，可用碱进行水解。分解为大豆异黄酮苷元和葡萄糖，但碱性条件下水解所得大豆异黄酮苷元很不稳定，容易降解。

Smith降解法：该法是一种氧化开裂法，比酸水解温和，能完整地保持苷元的结构，先用NaIO₄将糖的二羟基氧化开裂为二元醛结构，第二步用NaBH₄将二元醛结构还原成二元醇结构，第三步在室温条件下与稀酸作用使其水解。但由于此反应对葡萄糖进行开环，会有部分基团残留在苷元上，造成结构的复杂性以及不均一性。

酶催化水解：使用最多的大豆异黄酮糖苷水解酶是β-葡萄糖苷酶，大豆自身含有的内源β-葡萄糖苷酶水解活性不强，水解效率只有22％～29％。添加足量的高活性酶，如乳酸菌中提取的β-葡萄糖苷酶可使水解达到80％以上。能够水解大豆异黄酮糖苷的酶还有葡萄糖酸酶、α-半乳糖苷酶、生物乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等，它们都有很强的水解大豆异黄酮糖苷的能力。优势：酶具有高效率的催化能力，同时具有很高的专属性，能够对某一类特定物质或结构有专一性；作为生物催化剂，反应的前后不会发生性质和数量的改变，只有活性会有轻微的降低。且作用条件温和，与大豆异黄酮苷元在弱酸性的缓冲溶液中不易发生结构的变化。劣势：每次对大豆异黄酮进行酶解，得到活性较高的苷元部分时，需要对酶进行去除。普通的除酶手段，如进行煮沸离心，会有较大的蛋白质残留。同时也极大浪费了所用酶剩余的活性，造成生产成本的提高。

不同的固定化酶方式

因此，有必要研发一种高效降解大豆异黄酮制备大豆异黄酮苷元的方法，来解决现在大豆异黄酮苷元生产工艺复杂、效率低的难题。

发明内容

本发明目的是提供一种β-葡糖苷酶固定化方法，解决上述问题。

本发明的技术方案是：

一种β-葡糖苷酶固定化方法，包括步骤：

(1)通过化学键合将β-葡糖苷酶固定到聚甲基丙烯酸树脂上，形成酶固定化树脂；