[发明专利]重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的应用

说明书

本发明公开了重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的应用。本发明提供了提供的重组菌，为将恶臭假单胞菌KT2440的基因组按照如下改造，其他序列不变，得到重组菌：将所述恶臭假单胞菌KT2440基因组中的prpC基因缺失或者失活、ltaE基因缺失或者失活、bkd基因簇启动子替换为J23119启动子、lacI基因缺失或者失活、prpE基因缺失或者失活、rhtA基因缺失或者失活。本发明的实验证明了本发明得到的重组菌菌株PS11可以实现生产大量丙酸。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的应用。

背景技术

丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除草剂合成、有机合成中间体等方面。丙酸的生产方法有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法生产丙酸普遍面临反应条件苛刻、不宜分离纯化、容易造成环境污染等问题。而生物转化法生产丙酸需要建立高转化率的合成路线，减少副产物的积累，才能降低生产成本，形成具有推广前景的生产模式。苏氨酸是一种必需氨基酸，主要通过微生物发酵的方法制备，工艺简单成本低廉，因此可以作为生产丙酸的原料。

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是一种革兰氏阴性菌，广泛生长于土壤，水环境及植物根部，能够分解环境中的一些有机物，从而能够起到净化环境的作用，并且具有生物催化、生物排污等有益于人类的功能，被称为最具有开发潜能的一大类环境益生菌。其中恶臭假单胞菌KT2440(P.putida KT2440)是一株在全世界范围内得到详尽研究和应用的菌株，是第一个被美国卫生部重组DNA委员会(Recombinant DNA Advisory Committee，RAC)认定为对环境安全的格兰氏阴性细菌(1982年),并许可KT2440作为基因工程的宿主菌。

发明内容

为了提供新的制备丙酸的重组菌，本发明提供如下技术方案：

本发明一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为将假单胞菌的基因组按照如下1)-6)所有的方式改造、1)-5)所有的方式改造、1)-4)所有的方式改造、1)-3)所有的方式改造、1)和2)所有方式改造或1)所示的方式改造，其他序列不变，得到重组菌：

1)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性；

2)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性；

3)提高所述假单胞菌基因组中的支链酮酸脱氢酶复合物的活性；

4)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的乳糖操纵子阻遏蛋白(lacI)的活性；

5)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶A合成酶的活性；

6)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白(rhtA)的活性。

上述重组菌中，所述1)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性为将所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶prpC基因缺失或者失活；目的是减少了丙酸的降解；若lac启动子和大肠杆菌tdcBC基因插入缺失的prpC位点，则加强了苏氨酸到2酮丁酸的途径通路；

所述2)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性将所述假单胞菌基因组中的ltaE基因缺失或者失活；目的是阻断了苏氨酸到甘氨酸的途径通路；若lac启动子和大肠杆菌ilvA基因插入缺失的ltaE位点，则再次加强了苏氨酸到2-酮丁酸的途径通路；

所述3)中，所述提高所述假单胞菌基因组中的支链酮酸脱氢酶复合物的活性将所述假单胞菌基因组中的支链酮酸脱氢酶复合物bkd基因簇的启动子及调控基因bkdR替换为J23119启动子；目的是加强了2酮丁酸到丙酰辅酶A的途径通路；