[发明专利]一种增强谷氨酰胺酶耐盐性的方法

说明书

本发明公开了本发明涉及一种增强谷氨酰胺酶耐盐性的方法，属于生物工程技术领域。本发明主要是将两类自组装双亲短肽融合至YbgJ基因N端，得到耐盐性提高的两个融合酶AEAK‑YbgJ和LELK‑YbgJ。通过酶学性质分析，融合酶AEAK‑YbgJ和LELK‑YbgJ半衰期(t_1/2，55℃)较出发菌株分别提高58％、69％。在18％NaCl溶液中处理120min的残余酶活分别提高6.4倍和7倍；在20％NaCl环境中相对酶活分别提高0.6倍和1倍，两个融合酶耐盐性均得到提高。

技术领域

本发明涉及一种增强谷氨酰胺酶耐盐性的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

酱油作为东方传统食品，同时也是中式餐饮中常用的调味品。谷氨酸被认为是酱、酱油等大豆发酵食品中主要的鲜味氨基酸。在酱油酿造业中，通常利用谷氨酰胺酶水解酱油发酵原料中的谷氨酰胺生成谷氨酸，因此影响酱油发酵中谷氨酸得率的关键因素是酱油曲料中的谷氨酰胺酶的酶活力。酱油发酵过程中，在谷氨酰胺酶活力不高的情况下，部分谷氨酰胺会转变成一种无鲜味的物质——焦谷氨酸，此转化过程不可逆且影响酱油的口感和品质；当谷氨酰胺酶活力较高时，谷氨酰胺会尽可能多地转化成谷氨酸，提高酱油鲜味。由于谷氨酰胺酶的酶学性质、菌种制曲环境、微生物菌相、安全性等方面存在差异，不同的谷氨酰胺酶对酱油谷氨酸含量的提高效果有显著性差距。

由于酱油发酵的温度和盐浓度一般较高，耐盐耐热型谷氨酰胺酶更符合产业需求。酱油主要发酵菌株曲霉菌和米曲霉产生的谷氨酰胺酶在盐份高于15％(w/v)的条件下被显著抑制，而15-18％的盐浓度是生产酱油的常用条件。在酱油酿造过程中，如何提高谷氨酰胺酶活力、热稳定性和耐盐性，有效提高酱油中谷氨酸含量，进而提高酱油鲜味，已经成为酱油酿造业学者的目标。目前，关于提高谷氨酰胺酶耐盐性的方法甚少。Alexandra等对食品级乳酸菌(Lactobacilli)进行筛选，得到了一株产谷氨酰胺酶的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。该酶具有较高盐耐受性，即在5％(w/v)盐的存在下该酶活性增加两倍，在15％(w/v)盐的存在下该酶保留90％活性。韩铭海等筛选得到一株高产谷氨酰胺酶菌株，属于柠檬酸细菌属(Citrobacter)，该酶对NaCl有较好的耐性。大多数研究都侧重筛选菌株从而得到耐盐性较高的谷氨酰胺酶，这样的方法周期性长、目的性弱。目前，无有效的蛋白质改造的策略来提高酶的耐盐性，特别是分子改造提高耐盐性的技术非常罕见。

自组装双亲短肽(Self-assembling peptide,SAP)是一类亲疏水氨基酸交替分布，能自发组装成纳米结构的短肽，其特有的两亲性质使得其在水中能形成水凝胶，从而对目的蛋白或其他小分子进行固定化。SAP通过linker与酶融合，得到融合酶，融合后的SAP通过强化分子间疏水作用使酶分子形成刚性更强的寡聚体，提高酶热稳定性。大量研究显示，在蛋白N或C端融合SAP，能降低末端柔性，提高蛋白的热稳定性。中国专利CN102660570A公开了一种提高酶热稳定性的方法，是通过将双亲短肽与重组酶进行融合表达获得热稳定性提高的重组酶。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产谷氨酰胺酶(YbgJ)的重组枯草芽孢杆菌，融合表达了谷氨酰胺酶与双亲短肽，所述双亲短肽包括AEAK或LELK，所述AEAK含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述LELK含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，YbgJ的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，YbgJ基因的GenBank ID为938416。

在本发明的一种实施方式中，表达宿主包括B.subtilis WB600。