[发明专利]一种针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法

权利要求书

1.一种针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)将ProteinA磁珠储存液和ProteinG磁珠储存液分别充分混匀，然后将ProteinA磁珠储存液和ProteinG磁珠储存液按两种磁珠质量比1:1的比例充分混匀，得到混合磁珠储存液；

(2)在步骤(1)制得的混合磁珠储存液中加入IP Buffer并充分混匀以清洗混合磁珠，然后低温离心，使混合磁珠初步沉淀成块，进一步将混合磁珠储存液放到磁力架上磁力分离直至混合磁珠全部沉淀；重复上述操作再次清洗混合磁珠；

(3)在步骤(2)清洗后的混合磁珠中加入IP Buffer、10mg/ml的单链三文鱼精子DNA和10mg/ml BSA溶液，2～5℃旋转混匀封闭2～4h；其中，ProteinA磁珠、ProteinG磁珠、IPBuffer、单链三文鱼精子DNA溶液、BSA溶液的质量体积比为：600μg：600μg：1ml：30μl：75μl；取出封闭旋转后的混合磁珠，低温离心，加入IP Buffer按照步骤(2)所述的方法再次继续清洗1次；用IP Buffer重悬混合磁珠，得到预处理混合磁珠溶液；

(4)将组织样品液氮研磨成粉末后，加入冰上预冷的Douncing Buffer，使用匀浆机匀浆裂解2～3min；然后采用移液器反复吹打15～30次进一步消化裂解，最后采用带针注射器反复吸入和打出15～30次再次消化裂解，从而保证所有组织被完全消化裂解；其中，组织中脂肪比较多，匀浆机打不碎，匀浆裂解后如不采用移液器反复吹打，则很难用带针注射器反复吸入和打出，导致无法完全消化裂解；

(5)在消化裂解后的组织样品中加入微球菌核酸酶溶液36～38℃孵育6～10min后，加入终浓度为10mM的EDTA冰上孵育4～10min以终止反应；然后加入低渗裂解液并混匀，冰上孵育50～90min，期间每间隔8～12min颠倒混匀上述体系；最后低温离心，收集上清液；

(6)取步骤(3)制得的预处理混合磁珠溶液和步骤(5)制得的上清液按照体积比1：(1～10)的比例混合，2～5℃封闭旋转2～3h；低温离心，收集得到预清除背景DNA的上清液；

(7)将步骤(6)制得的预清除背景DNA的上清液进行免疫沉淀；

(8)将步骤(7)免疫沉淀后的样品进行清洗、洗脱、DNA纯化和检测。

2.根据权利要求1所述的针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的IP Buffer包含如下按终浓度计的组分：10mM Tris-HCl、1wt％Triton X-100、0.10wt％Deoxycholate、0.10wt％SDS、90mM NaCl、2mM EDTA、1×PIC。

3.根据权利要求1所述的针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的预处理混合磁珠溶液中ProteinA磁珠、ProteinG磁珠的终浓度为2μg/μl、2μg/μl。

4.根据权利要求1所述的针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的Douncing Buffer包含如下按终浓度计的组分：10mM Tris-HCl、4mMMgCl₂、1mM CaCl₂和1×PIC。

5.根据权利要求1所述的针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的组织样品和Douncing Buffer的质量体积比为30mg：250μl。

6.根据权利要求1所述的针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的微球菌核酸酶溶液初始浓为100Units/μl；

步骤(4)中所述的组织样品和步骤(5)中所述的微球菌核酸酶溶液的质量体积比为30mg：10μl。