[发明专利]一种针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法。本发明采用Douncing Buffer和特殊研磨手段等方式裂解猪骨骼肌组织，初步获得组织悬液，在微链球菌核酸酶的消化下，获得了高产量的且质量高的染色质，然后采用磁珠吸附的方式去除背景DNA，得到预清除背景DNA的上清液；最后将预清除背景DNA的上清液进行免疫沉淀、样品清洗、洗脱、DNA纯化和检测，该方法获得的染色质的产量和质量很高，适用于肝脏、脑、肺和胎盘等组织以及哺乳动物早期胚胎细胞核的收集，利用该方法可以使完整细胞核的产量最大化。同时，该方法保持了染色质制备过程中抗体识别表位的完整性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对组织的自然染色质免疫沉淀处理方法。

背景技术

在细胞和组织中，构成核小体的组蛋白表现出多种翻译后修饰，例如赖氨酸乙酰化、赖氨酸和精氨酸甲基化、丝氨酸磷酸化和赖氨酸泛素化等(Jenuwein,T.,and Allis,C.D.(2001).Translating the histone code.SCIENCE.)。这些核心组蛋白上的共价修饰在真核生物的染色质组织和基因表达中起着重要作用。研究证实组蛋白修饰能够激活或抑制转录，以及调节DNA修复和复制(Turner,B.M.(2002).Cellular Memory and theHistone Code.CELL 111,285-291.)。而要揭示生物体内特定位点组蛋白修饰作用，染色质免疫共沉淀技术是首选方法。

染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)是一种研究活体状态下组蛋白与DNA互作的实验技术(Rodríguez-Ubreva,J.,and Ballestar,E.(2004).Chromatin immunoprecipitation.Methods in Molecular Biology 285,41.)。其基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质与互作DNA的复合物，使用生物或者物理方法将其核小体间的Linker DNA随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，通过使用特异性抗体结合特异蛋白来获取能与目的蛋白相结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息(Collas,P.(2010).The Current State of ChromatinImmunoprecipitation.MOL BIOTECHNOL 45,87-100.)。ChIP不仅用于检测体内DNA与转录因子的动态作用，还被应用于研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。通过研究转录因子和靶基因启动子区域的直接互作关系，可以确定其在体内相互作用的动态变化，从而得到转录因子结合位点信息，以确定其靶基因(Orlando,V.(2000).Mappingchromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatinimmunoprecipitation.TRENDS BIOCHEM SCI 25,99-104.)。近年来，随着ChIP技术的不断完善，其已被广泛应用于研究体内转录调控因子和靶基因启动子上特异核酸序列结合(Nelson,J.D.,Denisenko,O.,and Bomsztyk,K.(2006).Protocol for the fastchromatin immunoprecipitation(ChIP)method.NAT PROTOC 1,179-185.)。