[发明专利]土壤三域微生物高通量绝对定量方法

权利要求书

1.土壤三域微生物高通量绝对定量方法，其特征在于：选用保藏编号为CCTCC NO:M2017770的大肠杆菌Escherichia coli WYL(E.coli WYL)作为三域通用内标菌株，包括以下步骤：

1)、将三域通用内标菌株E.coli WYL，重悬于无菌水中，得OD_600nm为0.9～1.0的菌悬液；

2)、土壤样品中三域通用内标菌株的添加：

吸取200μL步骤1)所得的菌悬液至2g土壤中搅拌混匀；

3)、土壤样品DNA提取；

4)、样品中三域通用内标菌株绝对定量：

采用Spec-F/R引物对土壤样品中三域通用内标菌株进行定量，反应体系(20μL)为：10μL SYBR Green qPCR SuperMix-UDG with Rox，正、反向引物各0.4μL，8.2μL无核酸酶水，1μL染色体DNA；反应条件如下：

实时荧光定量PCR反应条件

5)土壤样品高通量测序；

6)、三域微生物绝对含量计算。

2.根据权利要求1所述的土壤三域微生物高通量绝对定量方法，其特征在于所述步骤5)为：

采用通用引物515F/806R测定古菌和细菌微生物群落结构组成，并获得三域通用内标菌株在古菌和细菌微生物群落中的相对丰度；采用通用引物ITS-F/R测定真菌微生物群落结构组成，并获得三域通用内标菌株在真菌微生物群落中的相对丰度；

所获得高通量测序数据采用QIIME软件进行质控与过滤；正向与反向测序结果采用FLASH软件进行拼接；采用UPARSE软件将优质序列按97％的相似度归为一个OTU；

将三域通用内标菌株中人工设计515F/806R及ITS-F/R所对应碱基信息分别添加进SILVA数据库及Unite数据库，采用包含三域通用内标菌株碱基信息的SILVA数据库及Unite数据库分别对原核微生物及真核微生物OTU进行注释。

3.根据权利要求2所述的土壤三域微生物高通量绝对定量方法，其特征在于所述步骤6)为：

结合三域通用内标菌株的绝对含量AA_UISS及其在古菌和细菌微生物群落中相对丰度RA_{A+B_UISS}获得古菌与细菌微生物绝对总量TA_A+B(TA_A+B＝AA_UISS/RA_{A+B_UISS})；古菌与细菌微生物群落结构中，其他各水平(门、纲、目、科、属)分类单元绝对含量可通过绝对含量与该分类单元在原核微生物群落中相对风度的乘积计算获得(AA_{A+B_Taxon}＝TA_A+B×RA_{A+B_Taxon})；

结合三域通用内标菌株的绝对含量AA_UISS及其在真菌微生物群落中相对丰度RA_{F_UISS}获得真菌微生物绝对总量TA_F(TA_F＝AA_UISS/RA_{F_UISS})，真核微生物群落结构中，其他各水平(门、纲、目、科、属)分类单元绝对含量可通过绝对含量与该分类单元在真核微生物群落中相对风度的乘积计算获得(AA_{F_Taxon}＝TA_F×RA_{F_Taxon})。

4.根据权利要求1～3任一所述的土壤三域微生物高通量绝对定量方法，其特征在于所述步骤3)为：

参照MoBio DNA Isolation kit试剂盒说明书对土壤DNA进行提取，所提取土壤DNA置于-80℃保存待用。

5.根据权利要求1～3任一所述的土壤三域微生物高通量绝对定量方法，其特征在于三域通用内标菌株的培养为：

吸取200μL甘油(25％)-80℃保存的三域通用内标菌株于20mL LB培养基中，于37℃250rpm条件下培养14-16h后，4℃6000×g离心获得菌体，弃上清，并采用无菌水将菌体重悬浮，再次4℃6000×g离心，弃上清后重复无菌水重悬再离心步骤，最后将三域通用内标菌株重悬于无菌水中，得OD_600nm为0.9～1.0的菌悬液。