[发明专利]土壤三域微生物高通量绝对定量方法

说明书

本发明公开了一种土壤三域微生物高通量绝对定量方法，包括以下步骤：将三域通用内标菌株E.coli WYL重悬于无菌水中，得OD_600nm为0.9～1.0的菌悬液；土壤样品中三域通用内标菌株的添加；土壤样品DNA提取；样品中三域通用内标菌株绝对定量；土壤样品高通量测序；三域微生物绝对含量计算。本发明实现三域微生物绝对含量表征，从而达到三域微生物间可以跨样本跨域相互比较的目的；为推进三域微生物为整体的群落研究提供技术支持。

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种以高通量测序技术为基础，通过样品中三域通用内标菌株的添加和利用，实现三域微生物(古菌、细菌、真菌)高通量绝对定量的方法。

背景技术

微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物的统称，因为具有适应性强、易产生变异、可适应环境多样、种类丰富等特点，彰显出了巨大的开发潜能，广受医药、化工、农业、生态环境等各界学者关注。研究微生物多样性，探究微生物群落分布模式及变化机制，对于加深理解环境变化下微生物群落演替及响应机制并对其加以利用具有重要意义。

地球环境可分为五大圈层：大气圈、岩石圈、生物圈、水圈、土壤圈。作为五大圈层中与其他圈层交互最为频繁的界面，土壤圈具有最为复杂的内部结构，是地球上异质性极为明显的自然体，为微生物提供了复杂多样的生存环境，也因此涵盖了地球上数量最为庞大、种类最为丰富的微生物群体。

基于16S或18S rRNA/ITS基因序列的相似性差异，微生物可被划分为古菌域、细菌域和真菌域。环境中的三域微生物各有其优势：古菌可在于极端环境中生存，细菌种类丰富，真菌生物量大。揭示复杂的环境中三域微生物如何各司其职维持生态的平衡，古菌、细菌、真菌物种间如何竞争或互利共生，对于评价及进一步利用其生态功能具有重要意义。

纵观微生物群落结构研究方法发展史，研究手段经历了从传统的平板分离培养到深入探究微生物DNA分子水平的革新，微生物群落分子水平的研究方法克服了传统分离培养方法的局限，使得对微生物群落结构的解析更加深入和透彻。特别是高通量测序技术的出现，极大程度地推动了学者对微生物群落的理解：通过对微生物细胞内特定遗传物质的测定(16S rRNA或18S rRNA/ITS基因片段)，样本中微生物群落结构的多样性信息和含量组成可被进一步解析。

然而，就目前基于高通量测序技术的研究中，古菌域、细菌域、真菌域微生物是分域进行测序分析的，单个域内的优势物种及其相对丰度组成可被解析，但古菌、细菌、真菌微生物各自绝对含量的信息尚且缺乏，使得微生物群落结构组成信息“定性却又无法精确定量”，直接导致了三域微生物间无法相互比较，并进一步限制了基于微生物数量生态理论对三域微生物的探索。现有高通测序技术分析结果中，均以相对丰度的形式表征微生物的组成，在分析描述微生物变化时存在一定的问题：

一、当聚焦单域微生物变化时，相对丰度的描述形式可用于表征单个样品中不同分类单元的优势程度差异，而比较同一分类单元在不同样本中变化情况，特别是样本间微生物总量差异较大时，相对丰度的结果可能会导致错误的结论。该问题已由专利《土壤细菌高通量绝对定量方法》(专利号：201710296291.7)进行校正解决。

二、单个样品中，针对于各域的高通量测序结果只能孤立地表征其中一个域中不同分类单元的优势程度，而从属于古菌域、真菌域、细菌域的不同分类单元(Taxon)三域间的垮域比较难以实现。

三、当我们试图比较不同样本中不同域的分类单元的数量差异时，因域间及样本间本身存在的绝对总量的差异，若误用相对丰度来进行比较表征，将可能导致错误的结论。