[发明专利]一种中华绒螯蟹NKCC基因及其克隆方法和表达分析方法

权利要求书

1.一种中华绒螯蟹NKCC基因，其特征在于，所述中华绒螯蟹的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的中华绒螯蟹NKCC基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种如权利要求1所述的中华绒螯蟹NKCC基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：对不同物种的NKCC氨基酸序列进行对比，再根据对应的保守区域设计4对引物，以中华绒螯蟹腮总RNA反转录成cDNA第一链，进行PCR反应，获取中华绒螯蟹NKCC基因的核心片段，将所述核心片段连接到载体上并测序；

其中，4对所述引物包括NKCC-F1/NKCC-R1、NKCC-F2/NKCC-R2、NKCC-F3/NKCC-R3以及NKCC-F4/NKCC-R4，所述NKCC-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述NKCC-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述NKCC-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述NKCC-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述NKCC-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述NKCC-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述NKCC-F4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述NKCC-R4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

步骤2：根据所得中华绒螯蟹NKCC基因的核心片段，分别设计3’-NKCC RACE上游引物和5’-NKCC RACE下游引物，将提取的中华绒螯蟹总RNA反转录成3’-cDNA和5’-cDNA第一链，以此为模板，进行3’和5’末端片段RACE，将得到的3’和5末端RACE片段分别与载体连接，克隆并测序；

其中，所述3’-NKCC RACE上游引物如SEQ ID NO:11所示，所述5’-NKCC RACE下游引物如SEQ ID NO:12所示；

步骤3：将所得的3’和5’末端RACE片段以及中华绒螯蟹NKCC基因的核心片段分别去载体后，进行拼接，得到中华绒螯蟹NKCC基因的全长序列。

4.如权利要求3所述的中华绒螯蟹NKCC基因的克隆方法，其特征在于，步骤1和步骤2中，所述载体为pMD-19T。

5.利用权利要求3-4任意一项所述的中华绒螯蟹NKCC基因的克隆方法获得的中华绒螯蟹NKCC基因。

6.如权利要求1所述的中华绒螯蟹NKCC基因的表达分析方法，其特征在于，选择雄性中华绒螯蟹，取其肌肉、肝胰脏、血清、胃以及肠，分别提取总RNA，并进行cDNA合成，采用SYBRPremix Ex Taq Kit试剂盒进行实时荧光定量分析，根据权利要求3和4任一项所述的克隆方法获取中华绒螯蟹NKCC基因和18sRNA基因分别设计实时荧光定量PCR正反向引物qF1、qR1、18sF和18sR，并分别进行PCR，导出数据，进行溶解曲线分析，检测每份样品中NKCC基因和18sRNA的CT值，采用2-^△△CT法计算目的基因相对表达量，进行中华绒螯蟹NKCC基因的表达分析。

7.如权利要求6所述的中华绒螯蟹NKCC基因的表达分析方法，其特征在于，所述qF1的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述qR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述18sRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述18sRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

8.如权利要求6所述的中华绒螯蟹NKCC基因的表达分析方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应为两步法PCR扩增标准程序：95℃30s；95℃5s，62℃45s，共扩增40个循环；溶解曲线分析程序为：95℃15s，65℃60s，95℃30s。