[发明专利]一种中华绒螯蟹NKCC基因及其克隆方法和表达分析方法

说明书

本发明公开了一种中华绒螯蟹NKCC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。还公开了该基因的克隆方法，包括：对不同物种NKCC氨基酸序列比对后设计引物，中华绒螯蟹腮总RNA反转录成cDNA并经PCR扩增，获取NKCC基因核心片段；根据核心片段设计3’和5’端引物，将提取的总RNA反转录成3’和5’cDNA第一链，以此为模板RACE，获取3’和5末端RACE片段；将3’和5末端RACE片段分别与核心片段连接，得到NKCC全长序列。还公开了该基因的表达分析方法，显示在肠中表达量最高；通过盐胁迫实验推测该基因在渗透压调节中起重要作用。本发明为研究离子通道在中华绒螯蟹渗透调节中的作用机制提供了理论基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种中华绒螯蟹NKCC基因及其克隆方法和表达分析方法。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)隶属甲壳纲十足目方蟹科绒螯蟹属，是我国重要的经济蟹类，其味道鲜美，营养丰富，深受人们喜爱。中华绒螯蟹具有在半咸水中繁殖产卵、在淡水中育肥生长的特殊生活史，而水体PH、盐度、温度等环境因子能对水生甲壳动物的生长、繁殖、免疫等生理活动造成重要的影响，尤其盐度是一个重要的环境变量，生活在沿海地区的甲壳动物不得不通过自身渗透压的调节来应对环境盐度的变化，广盐性甲壳动物具备多样的渗透压调节能力。

NKCC是一种电中性离子跨膜转运蛋白，其在不同渗透调节时间点的表达模式决定了广盐性水生动物对盐度的适应。NKCC是氯离子共转运体家族的一员，在脊椎动物和无脊椎动物都有分布[Yang W etc.；2016]。NKCC能以1Na:1K:2Cl的比例对离子进行跨膜转运，在细胞渗透压调节，维持细胞离子平衡，调节细胞体积发挥重要作用。NKCC有两个基因亚型，分别是吸收亚型NKCC1(向体外分泌离子)和分泌亚型NKCC2(向体内吸收离子)。NKCC1在动物机体中分布更加广泛，而NKCC2主要分布在肾脏中。有研究表明，当鱼体处于高渗环境中，其机体的NKCC1被激活，向体外分泌离子，维持渗透压平衡[刘洪涛等，2016]。在鱼类中，NKCC在底鱂、鲨鱼、欧洲鳗鲡、欧洲鲈鱼、罗非鱼等被克隆并被大量研究[Yang W etc.；2016]。但还未见NKCC基因全长在中华绒螯蟹中的报道。

本实验成功克隆了中华绒螯蟹NKCC基因全长，并分析了其在中华绒螯蟹不同组织中的表达，以及分析了高盐度胁迫下，不同时间点中华绒螯蟹NKCC基因的表达；并测定高盐度胁迫下不同时间点中华绒螯蟹血清渗透压的变化和Na、Cl含量的变化。为 NKCC在中华绒螯蟹渗透压调节中的作用机制提供了研究资料。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种中华绒螯蟹NKCC基因的全称序列，以及该序列表达的蛋白。

本发明还有一个目的是提供一种中华绒螯蟹NKCC基因的克隆方法，通过不同物种氨基酸比对，根据对应保守序列设计4对引物克隆的核心片段和克隆的3’、5’末端片段经拼接获得中华绒螯蟹NKCC的全长序列。

本发明还有一个目的是提供一种中华绒螯蟹NKCC基因的表达分析方法，分析出NKCC基因在肠中表达量最高，其次是胸神经节，以为分析渗透调节机制提供必要的基础。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种中华绒螯蟹NKCC基因，所述中华绒螯蟹的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种所述的中华绒螯蟹NKCC基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种所述的中华绒螯蟹NKCC基因的克隆方法，包括以下步骤：