[发明专利]检测afamin浓度的试剂盒、制备方法及测定afamin浓度的方法

说明书

本发明公开了一种检测afamin蛋白浓度的试剂盒、制备方法及利用试剂盒检测afamin浓度的方法，检测试剂盒包括试剂1和试剂2，其中所述试剂1包括包被有单克隆抗人afamin抗体的顺磁性微粒；所述试剂2包括单克隆抗人afamin抗体‑碱性磷酸酶结合物。本发明的检测试剂盒具有开放属性，可以应用于多种不同公司的化学发光检测仪器，无需昂贵的专用配套仪器，易于在国内市场推广；而且采用本发明试剂盒检测尿液中afamin浓度的方法灵敏度高、检测时间短、操作简单，并且可同时检测大量样本，提高了检测效率，检测结果准确，为临床上肾病的诊断和治疗提供指导，具有较好的临床实用价值。

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种afamin化学发光检测试剂盒、制备方法及利用afamin检测试剂盒测定afamin浓度的方法。

背景技术

Afamin又称维生素E结合蛋白，是一种由肝脏合成的具有多种生物学效应的糖蛋白，分子量为75kDa，与白蛋白、甲胎蛋白、维生素D结合蛋白同属白蛋白家族。 Afamin的主要分子功能是运输维生素E，主要包括对α-生育酚和γ-生育酚的运输。研究发现，其存在于多种生物体液，比如血液、尿液、脑脊液、卵泡液和精液等。既往蛋白质组学研究发现尿液中afamin可能作为多种肾脏疾病的生物标志物，包括糖尿病肾病、小儿肾病综合征和慢性肾脏病。有研究发现在大鼠局灶节段肾小球硬化模型中，随疾病进展尿液afamin浓度逐渐升高，提示尿液afamin可能反映局灶节段肾小球硬化患者的疾病严重程度，同时有研究发现尿液afamin可以作为IgA肾病疾病严重程度的指标。

目前，检测血清afamin的主要方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，但由于ELISA 方法的灵敏度低、实验时间长、不适宜自动化分析等缺点，并不适合检测尿液afamin。发光免疫分析(CLIA)是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性。自从Schroder和Halman在20世纪70年代末用化学发光免疫分析测定甲状腺素以来，化学发光免疫分析技术发展很快。其检测原理与放射免疫 (RIA)和酶免疫(EIA)相似，不同之处是以发光物质作为底物，并借助其自身的发光强度直接进行测定。

CLIA是化学物质在化学反应过程中，由基态跃迁到激发态，再由不稳定的激发态回到基态，化学能转化为光能释放出来。将高灵敏度的化学发光与高特异度的免疫分析结合起来，通过检测光信号值(RLU，发光强度值)，即可知道待测物的含量。按照化学反应类型分类，可分为酶促化学发光和非酶促化学发光。化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物从而发光，用发光测定信号仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，他们有各自的发光底物，HRP常用的发光底物为鲁米诺及其衍生物，ALP常用的发光底物是3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)。在碱性条件下， ALP的发光底物AMPPD脱去磷酸根基团，形成一个不稳定的中间体AMPD，这个中间体随即自行分解，同时发射光子，这种发光物质发射的光稳定，持续时间可达几十分钟。

尿液中afamin的浓度高低，与肾损伤的严重程度直接相关，尿液中afamin的浓度高，说明患者的肾脏损伤程度高，因此，测定尿液中的afamin浓度，可以用于判断肾损伤的严重程度，对肾脏疾病的诊断和治疗具有明确的指导意义。

然而，现有的检测afamin浓度的方法仅有ELISA方法，其灵敏度低、耗时长、操作步骤复杂，不适宜于自动化分析，不能满足临床需要。CLIA既具有放射免疫分析的高灵敏度，又具有酶联免疫操作简便的特点，易于标准化，且测试中不使用有害的试剂。目前尚缺乏高灵敏度的尿液afamin化学发光检测试剂盒，因此有待开发对afamin检测灵敏度高、特异性好并能降低检测成本的化学发光检测技术。

发明内容