[发明专利]一种兰州百合茎尖脱毒与组培快繁方法

权利要求书

1.一种兰州百合茎尖脱毒与组培快繁方法，其特征在于：该兰州百合茎尖脱毒与组培快繁方法包括以下步骤：

S1：选择外观无腐烂症状的兰州百合植株，以其饱满、无病虫害、无损伤的健康鳞茎做繁殖材料，取中层鳞片作为外植体；

S2：所述鳞片先用中性洗涤剂流水冲洗20min，洗净后用自来水冲洗20 min，然后转至超净工作台依次采用质量浓度为10%的次氯酸钠处理5min，无菌水冲洗一次，质量浓度为0.1%的升汞溶液处理8min，无菌水冲洗一次，再转用体积浓度为75%的酒精处理30s后用无菌水冲洗三次，最后用质量浓度为0.2%的升汞溶液处理15min灭菌，无菌水冲洗6-8次，经消毒滤纸吸干表面水分，即得灭菌后的鳞片；

S3：将所述灭菌后的鳞片切成6mm×6mm的小块，按每150mL三角瓶接种8-15片且内面朝上接入组培苗培养基中，于20℃-26℃、光照强度为2000Lx-2500Lx、光照时间为12h的条件下进行培养，25-35d后即得不定芽；

S4：将所述不定芽切下，基部带部分鳞片组织，经继代培养成百合无菌组培苗；

S5：所述百合无菌组培苗依次在温度为39℃±1℃、光照强度为2000-30001x、光照时间为14h培养25-30d，温度为25℃±1℃、黑暗时间10h的条件下培养20d，即得热处理的组培苗；

S6：所述热处理的组培苗作为脱毒材料，剥去0.2mm-0.5mm的茎尖，按15-20个每瓶的接种量放入茎尖培养基中，于20℃-26℃、光照强度为2000-25001x、光照时间为12h的条件下进行培养，29-42d后即得脱毒茎尖；

S7：剪取2.0cm所述脱毒茎尖茎段，洗衣粉水浸泡5min后用自来水冲洗1h，其次用体积浓度为70%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.1%的升汞溶液处理12min灭菌，最后无菌水冲洗6次；然后解剖镜下按1.0-1.5mm、0.8-1.0mm、0.5-0.8mm、0.3-0.5mm、小于0.3 mm切取不同大小茎尖生长点，并分别按30-35个的接种量接种于脱毒培养基中，于22℃-28℃、光照强度为2000-25001x、、光照时间为12-15d的条件下进行培养，25-35d后即得脱毒茎尖；

S8：将所述脱毒茎尖转入鳞茎诱导培养基中，30d-40d后分化出小鳞茎；

S9：将所述小鳞茎按10-18个每瓶的接种量转入增殖培养基中，于22-25℃、光照强度为2000-25001x、光照时间为15-22d的条件下进行培养，25-30d后即得增殖鳞茎；

S10：将所述增殖鳞茎转入生根培养基中，于20℃-26℃、光照强度为2000Lx-2500Lx、光照时间为12h的条件下进行培养，25-35d后即得直径为0.5cm-1cm的鳞茎球；

S11：所述鳞茎球放入5℃±0.5℃冷库中，经4周-6周低温处理后，于-0.5℃-0℃冷库中冷藏即可。

2.根据权利要求1所述的一种兰州百合茎尖脱毒与组培快繁方法，其特征在于：所述S2的中性洗涤剂流水是指将洗衣粉1:75的比例进行稀释，后用稀释水对材料进行清洗。

3.根据权利要求1所述的一种兰州百合茎尖脱毒与组培快繁方法，其特征在于：所述S3培苗培养基是指在MS培养基中按1.0mg/L-2.0mg/L添加6-苄基嘌呤、0.1mg/L-0.5mg/L添加萘乙酸所得的pH值为5.8的培养基。

4.根据权利要求1所述的一种兰州百合茎尖脱毒与组培快繁方法，其特征在于：所述S6茎尖培养基是指在MS培养基中按6mg/L添加病毒唑、0.3mg/L-0.5mg/L添加6-苄基嘌呤、0.1mg/L-0.3mg/L添加萘乙酸所得的pH值为5.8的培养基。

5.根据权利要求1所述的一种兰州百合茎尖脱毒与组培快繁方法，其特征在于：所述S7脱毒培养基是指在MS培养基中按0.05mg/L添加6-苄基嘌呤、0.05mg/L添加萘乙酸所得的pH值为4.9的培养基。