[发明专利]一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用

说明书

本发明公开了一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法及应用。基于融合PCR技术以及T载体克隆技术，首次构建并鉴定PhoP/PhoR基因的置换型缺失突变载体T‑PhoPR，利用电转化技术使得重组的PhoP/PhoR基因缺失突变载体进入结核分枝杆菌感受态细胞，通过染色体同源重组以及多重筛选、鉴定，首次获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株。本发明构建的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株，同时敲除了参与调控MTB感受宿主微环境变化的PhoP基因和PhoR基因，可降低MTB的耐药性，使其对抗结核药物恢复敏感性，为探索MTB PhoP/PhoR双组分系统对结核分枝杆菌耐药性的调控机制提供一定的帮助，为进一步寻找新的抗结核药物作用靶点奠定基础提供依据。

技术领域

本发明属于重组基因、基因缺失突变菌株构建技术领域，涉及结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用。

背景技术

结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝核杆菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB) 感染引起的慢性传染病。其可侵及多种脏器，以肺部结核感染最为常见，排菌者为其重要的传染源，是一种严重危害人类健康的世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。目前，耐药结核病仍然是许多国家关注的主要公共卫生问题，世界卫生组织发布的《2018年全球结核病控制报告》公布的新数据显示：2017年，全球估计新发耐利福平结核病（RR-TB）患者55.8万例（范围：48.3-63.9万），56万人中有46万人为多重耐药结核病（MDR-TB），其比例高达82%。随着近年来结核分枝杆菌单纯耐一线抗结核药物以及多重耐药等现象日益严峻，致使中国结核病流行现状趋向复杂化, 然而结核分枝杆菌的耐药机制尚未明确，这给结核病的有效防治造成了极大困难。

结核分枝杆菌双组分系统(two-component system, TCS)广泛存在于MTB中，与MTB应对外界环境刺激发生相应的适应性变化明显相关。结核分枝杆菌PhoP/PhoR双组分系统是MTB全基因组所编码的12个完整的TCS之中最重要、最基本的双组分系统。该系统可调控MTB感受宿主微环境变化，并产生相应的细胞反应，使之能够更好地适应宿主微环境的变化，帮助MTB逃避宿主的免疫监视，同时对结核分枝杆菌在宿主体内的生长、分化、代谢、渗透调节、繁殖、毒性、趋化性、变异性、致病性等方面发挥着重要的调控作用。

结核分枝杆菌PhoP/PhoR双组分系统可分为感受器PhoR和效应器PhoP两部分。PhoR基因与PhoP基因是相互作用的同源对，基因结构关系密切，上游的PhoP基因突变对下游PhoR基因的表达有影响作用，可能的原因是PhoP/PhoR基因是共转录的。当致病性MTB侵入机体并被巨噬细胞吞噬，MTB对宿主微环境的感知主要是通过PhoR感受器实现的，而目前在临床上对致病性MTB引起的结核病的治疗，主要是通过使用一线抗结核药物来杀伤MTB以达到治疗目的。抗结核药物及其药物浓度的不同对结核分枝杆菌生存的微环境来说也是一种环境刺激因素，并且抗结核药物成为PhoR调节MTB适应外界环境的一个重要刺激因子。但由于临床上病人对抗结核药物治疗的依从性不高，使得药物对MTB的杀伤作用不彻底，这有可能是由于MTB的PhoR对自身细胞壁或细胞膜结构的调节抵抗抗结核药物的杀伤作用的结果。PhoP 基因是MTB的一种重要调节因子，可正向调节毒力因子多腺脂和二腺脂。有研究表明，与野生型MTB H37Rv菌株相比，MTB PhoP突变株对万古霉素以及氯唑西林更敏感，因此认为MTB PhoP/PhoR双组分系统在MTB耐药性的产生中具有重要作用，并且进一步推测MTB耐药的机制可能是PhoP/PhoR双组分系统通过调控一个或多个药物外排泵基因的表达以及调控其菌壁通透性，使药物外排或不能进入细胞发挥作用，最终导致MTB耐药。

基因敲除技术是基因功能研究中常用的方法之一，通过特定技术使得生物体某个基因精确失活或缺失，与野生型生物体表型进行比对，并依据其变化而认识该基因的功能。而PhoP/PhoR双组分系统对MTB耐药性的调控机制尚未明确，基于此，我们提出利用基因敲除技术构建一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株，具有以下有优势：