[发明专利]胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒

权利要求书

1.一种胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒，其特征在于，所述胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒，包括核苷酸序列mir-30c和内参；

所述miR-30c核苷酸序列为：5′-TGTAAACATCCTACACTCTCAGC-3′；

所述内参为U6 snRNA：U6引物上下游的引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’与5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.如权利要求1所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒，其特征在于，所述miR-30c相对表达量的计算方法：2^-ΔCt循环值计算，ΔCt＝Ct^miR-30c-Ct^U6。

3.一种利用权利要求1所述胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：

步骤一，血清样本的处理，采血、离心、保存备用；

步骤二，总RNA的提取，提取得到的总RNA放于-80℃冰箱保存备用；

步骤三，进行吸光度检测，利用RNA甲醛变性胶电泳判断RNA的质量；

步骤四，进行反转录获得cDNA，将得到的cDNA进行荧光定量检测；

步骤五，采用相对定量法对检测结果进行分析。

4.如权利要求3所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，血清样本的处理具体为：

所有纳入人群均取清晨空腹静脉血3ml，并立即用水平离心机以2000rpm离心8min分离血清，吸出的上清置于离心管中，于4℃条件下14000x rpm离心10min，吸出的上清液置新的离心管中，放到-80℃冰箱低温保存以便用于总RNA的提取。

5.如权利要求3所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，总RNA的提取，具体步骤为：

(1)提取总RNA；

(2)加入10倍体积的裂解/结合缓冲液匀浆器彻底混匀；

(3)加入1/10体积的匀浆液添加物，涡旋混匀，冰上放置10分钟；以上操作均在冰上进行；

(4)加入与裂解液相同体积的酸性-苯酚：氯仿，300ul裂解液/300ul酸性-苯酚：氯仿，涡旋30-60秒，室温10，000g离心5分钟，分相不好,重新离心；取上清置一新管中，记体积；

(5)加入1.25倍体积100％乙醇，涡旋混均，反复过纯化柱，体积不超过700ul，10，000g离心约15秒；

(6)加入350ul洗液1，离心5-10秒，清洗纯化拄，10，000g离心约15秒，弃过滤液；

(7)DNaseI10μl和Buffer RDD70μl加入膜上，20-30℃放置15分钟；

(8)加入350ul洗液1,离心5-10秒，清洗纯化拄，10，000g离心15秒，弃过滤液；

(9)加入500ul，洗液，2/3，离心5-10，秒，清洗纯化柱二次，10，000g离心15秒，弃过滤液，离心1分钟；

(10)将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加入100μL95℃预热的清洗剂ElutionSolution或无RNA酶的水中，室温最高转速离心20-30秒，收集管中液体即为提取的总RNA，放置在-80℃保存。

6.如权利要求3所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤三中，吸光度检测方法：

(1)取2ul溶解的RNA，加入98ulRNase-free dd H₂O；

(2)用核酸分析仪检测RNA的产量；

(3)测定在260mm处的吸光度，1OD＝40ug/ml,按如下公式计算：

总RNA的浓度为：A260×40×稀释倍数。