[发明专利]一种基于四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）四氧化三铁纳米粒子的制备：将0.2 g十二烷基硫酸钠、1.5 g醋酸钠和0.5 g三氯化铁加入到15 mL乙二醇中，在室温下搅拌30分钟，然后将该混合溶液转移到聚四氟乙烯高温反应釜中并在200 ℃下加热12小时，将所得产物用超纯水和乙醇分别洗涤三次，最终产物在35 ℃下真空干燥12小时，干燥后研磨并在室温保存；

（2）四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料的制备：将100 mg四氧化三铁纳米粒子和200mg多巴胺加入到120 mL pH为8.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和100 mL异丙醇混合溶液中，搅拌13小时后，得到黑色的悬浊液，使用磁铁对溶液进行磁分离收集产物，并将产物用超纯水洗涤五次以除去未反应的物质，然后在35 ℃真空中干燥，干燥后称重并重新分散在5 mL超纯水中，放于4 ℃冰箱冷藏保存；

（3）四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的降钙素原抗体溶液的制备：取50 μL四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料分散液用5 mL、0.1 mol·L^-1、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释，向其中加入2 mL浓度为10 μg·mL^-1的降钙素原检测抗体溶液，在4 ℃下孵化2 h，离心，再加入100 μL 0.1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点，在4 ℃下孵化2 h，离心分离得到固体产物，将其重新分散于5 mL、0.1 mol·L^-1、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的降钙素原抗体溶液；

（4）与抗原特异性结合的四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的降钙素原抗体溶液的制备：将四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的降钙素原抗体溶液与0.1 ng·mL^-1的抗原以体积比1:1混合，室温下孵化1 h，离心分离，得到与抗原特异性结合的四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的降钙素原抗体溶液；

（5）四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的制备：向96微孔板中加入100 μL浓度为1 μg·mL^-1的降钙素原的捕获抗体溶液，在4 ℃下孵化12 h，用磷酸盐缓冲液洗板三次，再加入100 μL、0.1%的牛血清白蛋白溶液封闭微孔板上的非特异性结合位点，室温孵化1 h，再用磷酸盐缓冲液洗板三次，向其中加入与抗原特异性结合的四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的降钙素原抗体溶液，孵化1 h，用超纯水洗板三次，向微孔中加入200 μL浓度为1mmol·L^-1的三氯化铁和铁氰化钾的混合溶液，反应1 min后用移液枪去除混合溶液，用超纯水洗板三次，制得四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物；

（6）免疫显色过程：向制得四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的96微孔板中加入100μL浓度为1.248 mmol·L^-1的3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液和100 μL浓度为6 mmol·L^-1的过氧化氢溶液，微孔板中的溶液由无色变为蓝色，显色时间为15 min，显色结束后加入50μL浓度为1 mol·L^-1的硫酸终止液，微孔板中的溶液由蓝色变为黄色，用酶标仪测量350nm-900 nm溶液的吸光度。

2.根据权利要求1所述的四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的制备方法，其特征在于，所述的标记物用于对显色液进行催化显色。

3.根据权利要求1所述的制备的基于四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的酶联免疫吸附实验作为降钙素原检测的应用。

4.根据权利要求3所述的酶联免疫吸附实验作为降钙素原检测的应用，其特征在于，检测步骤如下：

（1）包被：向96微孔板中加入100 μL浓度为1 μg·mL^-1降钙素原的捕获抗体溶液，4 ^°C下孵化12 h，用磷酸盐缓冲液洗板三次，甩干；

（2）封闭：用100 μL 0.1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点，37 ^°C下孵化1h；

（3）加样：甩去牛血清白蛋白溶液，加入与抗原特异性结合的四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的降钙素原抗体溶液，37 ^°C下孵化1 h，用磷酸盐缓冲液洗板三次，甩干；

（3）纳米酶：向微孔中加入200 uL三氯化铁和铁氰化钾的混合溶液，反应1 min后用移液枪去除混合溶液，用超纯水洗板三次；

（4）显色：每孔先后加入显色剂A、B各100 μL；

（5）终止：每孔加入50 μL终止液；

（6）检测：于TECAN酶标仪上检测450 nm波长处的吸收值。