[发明专利]一种基于四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的制备方法及应用，涉及纳米科学、生物免疫技术、酶免疫测定技术等领域。本发明利用普鲁士蓝优异的催化性能，制备了负载在四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料上的普鲁士蓝纳米酶标记物。通过利用四氧化三铁球芯的磁性和聚多巴胺优异的生物相容性，实现了生物分子的固定以及磁分离。通过利用聚多巴胺在酸性条件下具有还原三价铁离子的能力，成功在聚多巴胺表面生成普鲁士蓝纳米酶作为标记物。普鲁士蓝纳米酶通过催化过氧化氢的氧化反应，使底物四甲基联苯胺由无色变为蓝色。该标记物可以适用于多种酶联免疫试验的制备，在科研和临床中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及纳米科学、生物免疫技术、酶免疫测定技术等领域，具体涉及一种酶联免疫反应标记物的制备方法及应用。

背景技术

生物标志物检测是目前唯一无创的早期预警癌症等疾病的方法，在临床中对肿瘤的普查、诊断及判断预后等具有十分重要的意义。在众多的生物标志物检测方法中，酶联免疫技术由于其检测迅速，方法简单，特异性强和灵敏性高等优点而成为生物分子定量检测的主要分析技术。

酶联免疫吸附试验是利用吸附在固相载体上的抗原或抗体与酶标记抗体发生特异性结合。向其中加入底物溶液后，底物会在酶的作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，发生颜色反应。因此，可以根据底物的颜色反应来判断有无对应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。这种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，通过将抗原抗体反应的特异性和酶化学反应的敏感性相结合，使酶联免疫吸附试验成为一种既特异又灵敏的检测方法。鉴于此，发明一种具有催化性能的纳米酶作为标记物用于酶联免疫吸附试验中，具有重要的现实意义。

通过利用四氧化三铁球芯的磁性和聚多巴胺优异的生物相容性，不仅实现了生物分子的固定以及磁分离，而且大大提高了纳米复合物表面抗体的结合量，实现易于标记的制备效果。普鲁士蓝纳米酶被称为“人工酶过氧化物酶”，因为它对还原过氧化氢表现出高特异性和催化性能。与传统的将铁盐和六氰基铁酸盐与不同氧化态的铁原子混合制备普鲁士蓝的方法不同，使用四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料还原铁氰化物-铁离子混合物可以在复合材料表面得到普鲁士蓝纳米酶用做标记物，进一步实现对显色液的催化显色。通过酶标仪进行定量测定实现对抗原浓度的检测。

本发明利用普鲁士蓝优异的催化性能，制备了负载在四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料上的普鲁士蓝纳米酶标记物。通过利用四氧化三铁球芯的磁性和聚多巴胺优异的生物相容性，实现了生物分子的固定以及磁分离。通过利用聚多巴胺酸性条件下具有还原三价铁离子的能力，成功在聚多巴胺表面生成普鲁士蓝纳米酶作为标记物。普鲁士蓝纳米酶通过催化过氧化氢的氧化反应，使底物四甲基联苯胺由无色变为蓝色。

发明内容

本发明的目的之一是提出一种利用聚多巴胺还原铁氰化物-铁离子混合物在四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料表面制备普鲁士蓝纳米酶的方法。

本发明的目的之二是利用普鲁士蓝对过氧化氢的催化作用，实现显色液颜色的变化

本发明的目的之三是所制备的标记物用于标记抗体构建夹心型酶联免疫吸附试验，既可以对生物标志物进行高效灵敏的检测，还可以实现定量检测。

本发明的技术方案如下：

一种基于四氧化三铁/普鲁士蓝纳米酶标记物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）四氧化三铁纳米粒子的制备：将0.2 g十二烷基硫酸钠、1.5 g醋酸钠和0.5 g三氯化铁加入到15 mL乙二醇中，在室温下搅拌30分钟，然后将该混合溶液转移到聚四氟乙烯高温反应釜中并在200 ℃下加热12小时，将所得产物用超纯水和乙醇分别洗涤三次，最终产物在35 ℃下真空干燥12小时，干燥后研磨并在室温保存；