[发明专利]一种亲水性短肽的纯化方法

说明书

本发明公开了一种亲水性短肽的纯化方法，包括去除三氟乙酸、凝胶色谱脱盐和离子交换树脂吸附及洗脱收集的步骤；所述去除三氟乙酸的步骤包括将切割亲水性短肽的三氟乙酸溶液加水冻干，以及加入碱进行中和；所述凝胶色谱脱盐和换盐包括中和后的多肽溶液上样、洗脱、收集；所述离子交换色谱纯化亲水性短肽的步骤包括将所述短肽溶液吸附到阳离子树脂，吸附，洗脱收集洗脱液，检测。其亲水性短肽容易析出，在反相色谱中保留能力强，纯化后的纯度高。

技术领域

本发明涉及纯化方法，具体涉及一种亲水性短肽的纯化方法。

背景技术

近年来，一些活性多肽被发现，例如富含精氨酸的穿膜肽等，这些多肽有几个共同的特点：1.肽链较短，一般少于30个氨基酸的长度，比较常见的如二肽、三肽等；2.含有较多的亲水氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸等)，这些氨基酸在纯化时处理出现了一些问题，由于极性比较大，在反相制备柱中保留效果比较差，所以样品的分离效果也比较差。

目前多肽的合成一般采用的是固相合成的方法，通过BOC法或者FMOC法把氨基酸依多肽序列偶联在一起，所以合成的粗品中可能会含有和目标肽性质极其相近的残肽，这样的残肽和目标多肽一般比较难以分离开来。

反相色谱纯化多肽的方法已经比较成熟，但还是存在不尽如人意的方面，例如上面所述的两种情况。所以开发其他纯化方法具有现实意义。

离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质和多肽的分离纯化。由于多肽有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的多肽，所以这类多肽被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的多肽洗脱下来。结合较弱的多肽首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的多肽，结合的多肽可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

含有多个碱性氨基酸的短肽纯化比较困难，是由于多肽本身的性质决定的，在纯化过程中不容易在常规的反相柱中有保留，而且，由于比较亲水，使用乙醚或石油醚将其从切割液中析出比较困难。目前对这类多肽的制备方法报道很少，一般采用反相制备的延长柱子长度，改变填料的方法纯化得到成品，但该方法只能有限的增加短肽保留时间，而且会一定程度造成柱子的损坏，成本消耗较高。有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种亲水性短肽的纯化方法，能够提高多肽的收率，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种亲水性短肽的纯化方法，其亲水性短肽容易析出，在反相色谱中保留能力强，纯化后的纯度高。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种亲水性短肽的纯化方法，包括以下步骤：

S1，切割液后处理：

a.在无法析出亲水性短肽的三氟乙酸切割液中，加入0.1～10倍体积的水，液氮预冻后上冻干机，直至冻干瓶中出现固体；

b.而后加入适量的0.1％三乙胺溶液调节pH到5～7，获得中和后的多肽溶液。

S2，凝胶色谱脱盐换盐：

c.将多肽溶液上样到凝胶柱中，总上样量为1～10倍凝胶柱的体积；

d.选用1～5倍凝胶柱体积的无盐水或pH为4～5的0.1％醋酸-乙酸铵作为洗脱液进行洗脱冲洗；

e.洗脱后收集各组分，质谱确认目标峰后作为凝胶柱收集液。

S3，离子交换色谱纯化：