[发明专利]一种粒细胞集落刺激因子重组蛋白、缀合物及其应用

权利要求书

1.一种粒细胞集落刺激因子(G-CSF)重组蛋白，其包括粒细胞集落刺激因子活性多肽以及包含Sortase酶识别位点的多肽区段P，所述活性多肽与所述多肽区段P直接连接或者通过接头L连接，所述多肽区段P优选连接于所述活性多肽的C端或者N端，更优选C端；所述Sortase酶例如是Sortase A或Sortase B；优选的，所述多肽区段P包含Sortase A的核心识别位点LPXTG，其中X是任意氨基酸，例如LPETG、LPETGG或LPETGGG；还优选的，所述多肽区段P还包含与Sortase酶识别位点连接的亲和标签，例如，所述多肽区段P选自LPETGGHHHHHH和LPETGGWSHPQFEK。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其中所述粒细胞集落刺激因子活性多肽源自人；优选地，所述粒细胞集落刺激因子活性多肽可包含1个或更多个氨基酸突变，条件是仍保留其活性；例如所述粒细胞集落刺激因子活性多肽包含SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或更高的一致性。

3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白，其中所述接头L为包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的肽段；优选地，所述接头L为包含甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、丙氨酸(Ala，A)和/或苏氨酸(Thr，T)的柔性肽段，例如，(GS)_w(GGS)_x(GGGS)_y(GGGGS)_z，其中w、x、y和z分别选自0至50的整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，还优选地，w、x、y和z不同时为0；

更优选地，所述接头L的序列为：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组蛋白，其包含如SEQ ID NO：1所示的序列，或者由如SEQ ID NO：2所示的核酸分子编码。

5.一种缀合物，其中亲水聚合物分子连接至权利要求1至4中任一项所述重组蛋白的末端，所述末端例如N末端或者C末端，优选地经转肽反应连接至所述Sortase酶识别位点。

6.根据权利要求5的缀合物，其中所述亲水聚合物分子选自多糖和聚亚烷基二醇，如聚丙二醇和聚乙二醇；所述聚亚烷基二醇可以是末端封端的，例如经烷氧基如甲氧基封端的；和/或所述聚亚烷基二醇是直链的或支链的；所述聚亚烷基二醇的分子量可以是＝1、＝10、＝20、＝30、＝40、＝50、＝60、＝70、＝80、＝90、＝100、＝110、＝120、＝130、＝140、＝150或＝160kDa，例如是5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kDa，或者以上任意二数值之间的值；优选地所述亲水性聚合物分子的分子量是40kD。

7.一种制备权利要求5或6所述缀合物的方法，其中包括使权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白与Sortase酶(如Sortase A或Sortase B)和亲水聚合物分子接触，其中所述亲水聚合物分子一端带有可被Sortase酶酰胺化的氨基，优选地，所述亲水聚合物分子的一端带有聚Gly，例如GGGAA。

8.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白和/或权利要求5或6所述的缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。

9.根据权利要求8的药物组合物，其用于在有需要的患者中提高白细胞计数；优选的，所述患者患有或者有风险罹患嗜中性粒细胞水平不足，例如所述患者患有或者有风险罹患中性粒细胞减少症。

10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其为液体制剂形式或冻干制剂形式。