[发明专利]一种粒细胞集落刺激因子重组蛋白、缀合物及其应用

说明书

本发明涉及粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)重组蛋白以及缀合物，其制备方法及其在白细胞数量减少相关疾病的治疗方面的应用。

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白或者重组蛋白的缀合物，特别涉及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)重组蛋白以及缀合物，制备所述重组蛋白和缀合物的方法以及其在中性粒细胞减少症的治疗方面的应用。

背景技术

中性粒细胞减少是肿瘤放化疗中常见的不良反应，是引起化疗延迟和减量的首要原因，也是导致放疗暂停的重要原因，随之引起的中性粒细胞减少性发热(febrileneutropenia，FN)可危及生命，是最重要的肿瘤急症之一。

人粒细胞集落剌激因子(G-CSF),是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，能够通过特异性结合细胞髓细胞表面的受体，刺激嗜中性粒细胞的前体进行分裂，促进血液中的中性粒细胞数增加。目前市面上存在多种商业化的G-CSF制剂被用于治疗中性粒细胞减少症，如非格司亭(filgrastim)(商品名为)、雷诺司亭(lenograstim)(商品名为和)、那曲司亭(nartograstim)(商品名为)等和国产药物瑞白等。

然而，天然的G-CSF全长174个氨基酸残基，分子量较小，容易被肾小球过滤，在体内的半衰期很短，通常只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天，影响了患者的依从性。因此通过将G-CSF与其他分子偶联增加分子量能够提高蛋白质的半衰期。例如将G-CSF与白蛋白和IgG偶联，通过FcRn介导的内吞保护作用，使G-CSF不被降解和代谢，延长了半衰期。此外，偶联20KD聚乙二醇的重组人粒细胞集落剌激因子制剂培非格司亭(pegfilgrastim)(商品名)以及国产药物新瑞白，均显著延长了G-CSF的半衰期。

不过，现有的PEG的G-CSF制剂虽然可以延长G-CSF体内半衰期，但是由于活性位点的封闭或空间位阻效应往往伴随着生物学活性的下降，就导致临床应用时需要加大剂量制剂以保证治疗效果，同时带来了各种G-CSF治疗的副作用，例如骨痛等。因此，本领域迫切需要体内活性更好的G-CSF长效试剂。

发明内容

发明人意外的发现，如果改变PEG与G-CSF偶联的方式，即通过在G-CSF的末端(优选C末端)通过Sortase酶定点偶联PEG，特别是40KD的PEG，不但能够显著改善G-CSF的半衰期，还能够最大限度的保留其活性，所获得的技术效果显著优于市面上已有的PEG修饰药物(例如新瑞白)，从而完成了本发明。具体的，本发明提供以下实施方案：

在第一个方面中，本发明提供了一种粒细胞集落刺激因子(G-CSF)重组蛋白，其包括粒细胞集落刺激因子活性多肽以及包含Sortase酶识别位点的多肽区段P，所述活性多肽与所述多肽区段P直接连接或者通过接头L连接，所述多肽区段P优选连接于所述活性多肽的C端或者N端，更优选C端；所述Sortase酶例如是Sortase A或Sortase B；优选的，所述多肽区段P包含Sortase A的核心识别位点LPXTG，其中X是任意氨基酸，例如LPETG、LPETGG或LPETGGG；还优选的，所述多肽区段P还包含与Sortase酶识别位点连接的亲和标签，例如，所述多肽区段P选自LPETGGHHHHHH和LPETGGWSHPQFEK。

在一个实施方案中，所述粒细胞集落刺激因子活性多肽源自人，如人粒细胞集落刺激因子活性多肽；所述人粒细胞集落刺激因子活性多肽相比较野生型序列可包含1个或更多个氨基酸突变，条件是仍保留其活性；例如所述人粒细胞集落刺激因子活性多肽包含SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或更高的一致性。