[发明专利]一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合

说明书

本发明属于动物病毒防制技术领域。具体涉及一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合，与靶DNA片段的检测领域相关。筛选了一组高灵敏、特异性的LAMP引物，使用NCBI BLAST在线软件分析针对非洲猪瘟病毒基因组序列的特异性基因B646L，利用LAMP primerexplorer网页对该病毒特异性片段设计多组特异性引物，得到灵敏性最高，特异性最强的LAMP引物。利用LAMP快速扩增模版DNA特异性区域，通过加入荧光染料，可在荧光定量PCR仪上完成反应及结果判定，整个反应不超过50min。本发明筛选引物组合具有灵敏度高、特异性强特点。本发明LAMP方法操作简单，成本低，结果易于判断。

技术领域

本发明属于动物传染病仿制技术领域，具体涉及一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，简称ASFV)属于非洲猪瘟病毒科，是该科的唯一成员，也是虫媒传播病毒中唯一一个DNA病毒。病毒中心是直径为70—100nm的电子密度较高的DNA核心，核心外周是直径172-191nm呈二十面体对称的衣壳和含脂类的囊膜。基因组为双股线状DNA，大小为170-190kb。整个基因组有151个开放性阅读框，编码150-200种蛋白质。非洲猪瘟病毒能引起非洲猪瘟，它是猪的一种急性、烈性传染病，临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大，被世界动物卫生组织(OIE)列为一类疫病。

世界动物卫生组织提供的陆地诊断手册中关于非洲猪瘟检测方法部分提到：非洲猪瘟不能通过临床检查或尸检与经典猪瘟区分开来，而且和猪的任何急性发热性出血综合征都容易混淆。因此，实验室检查对于区分这些疾病至关重要。目前实验室检查针对该病已经建立了多种诊断方法。这些方法虽在实际诊断中发挥巨大作用，但也有其不足之处，例如有的操作繁杂，有的耗时费力。LAMP技术操作简单，灵敏，快速,，检测成本低,，且不需要特殊仪器设备,，具有较高的临床实用性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合。

本发明通过优化了一组高度灵敏、特异性的LAMP引物，进一步优化了非洲猪瘟病毒的LAMP检测方法。利用NCBI BLAST在线软件分析找到非洲猪瘟病毒特异性基因B646L的核苷酸序列，利用LAMP primerexplorer在线网页(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)针对该病毒基因特异性片段设计多组特异性引物，通过试验，最后优化、筛选出灵敏性最高，特异性最强的引物。通过加入荧光染料，可在荧光定量PCR仪上完成反应及结果判定，整个反应不超过50min，且无需复杂的检测仪器和检测过程，对非洲猪瘟病毒现场实时检测具有很好的应用价值。

本发明的技术方案如下所述：

一种高灵敏、特异性地检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法，包括如下步骤：

(1)根据文献报道选取非洲猪瘟病毒的特异性保守基因B646L(GenBank登录号MH722357.1)，并确定基因序列的准确性；

(2)根据步骤(1)确定的序列，利用LAMP primer explorer在线网页(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计如下多种特异性引物，这些引物分别针对特异性保守区的6个区域，每组引物包括一对F3/B3内引物，一对FIP/BIP外引物和一对LF/LB环引物；对多组特异性引物进行筛选，最后确定出特异性最强、灵敏度最高的引物进行扩增；所述的LAMP引物的序列如下所述：

外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT(与序列表SEQ ID NO:1所示的序列相同)；

B3:ATACCACAAGATCAGCCG(与序列表SEQ ID NO:2所示的序列相同)；