[发明专利]RNF213基因完整敲除纯合子斑马鱼的制备方法和用途

权利要求书

1.一种rnf213a基因完整敲除纯合子斑马鱼的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、设计针对斑马鱼rnf213a基因2号外显子靶序列的TALEN序列；

S2、构建TALEN左、右臂质粒，并分别体外转录出TALEN左、右臂mRNA；

S3、将TALEN左、右臂mRNA混合并注射到转基因斑马鱼胚胎中，提取胚胎DNA测序发现TALEN的mRNA能作用于rnf213a基因2号外显子；

S4、将注射后的胚胎培养至F0代，并与野生型成鱼交配，获得F1代成鱼；

S5、鉴定F1是否存在rnf213a基因突变，并经DNA测序鉴定rnf213a基因突变类型，将含有rnf213a基因突变的杂合子与野生型外交3代，净化其遗传背景；

S6、将同种基因型的杂合子杂交得到纯合子两种基因型：+2bp及-7bp。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的斑马鱼rnf213a基因2号外显子靶序列为SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的TALEN序列的左臂序列如SEQ ID NO.2所示；右臂序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的TALEN序列还包括能识别不同碱基的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，其中识别碱基A的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；识别碱基T的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；识别碱基C的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；识别碱基G的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中还包括将构建的质粒转化低拷贝的感受态细胞，将其扩大培养后，提取质粒，经限制性内酶切DNA测序鉴定，确定质粒DNA序列。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述针对质粒测序设计的正向引物如SEQ ID NO.12所示；反向引物如SEQ ID NO.13所示。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中经鉴定含有rnf213a基因突变的成鱼F1杂合子为+2bp突变体及-7bp突变体。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中纯合子分别为+2bp突变体及-7bp突变体。

9.一种如权利要求1所述的制备方法建立的rnf213a基因敲除斑马鱼突变体纯合子模型在作为针对烟雾病或/和海绵状血管瘤的药物筛选模型中的用途。