[发明专利]RNF213基因完整敲除纯合子斑马鱼的制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种rnf213a基因完整敲除斑马鱼突变体的制备及其应用；设计针对斑马鱼rnf213a基因的TALEN序列；构建其左右臂质粒，并体外转录出相应的mRNA；将TALEN左右臂mRNA混合并注射到斑马鱼胚胎中；注射后的胚胎养至F0成鱼与野生型成鱼交配，将携带有rnf213a基因突变的胚胎养至F1成鱼；F1代鱼剪尾基因型鉴定发现存在两种杂合子基因型：+2bp及‑7bp；将杂合子与野生型成鱼外交3代，净化其遗传背景后，再将同种基因型的杂合子杂交得到纯合子两种基因型：+2bp及‑7bp。纯合子与纯合子杂交得到的胚胎进行表型观察发现存在与人相似的烟雾病表型及海绵状血管瘤表型。本发明通过TALEN基因编辑技术，能够快速高效的建立rnf213a基因完整敲斑马鱼品系，利用该模型能够开展针对烟雾病或/和海绵状血管瘤的药物筛选工作。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及利用基因打把技术敲除斑马鱼rnf213a基因的方法。

背景技术

RNF213基因位于17号染色体，编码包含5207个氨基酸的环指蛋白，该基因有两个重要的功能区RING finger domain及AAA+ATPases domain。近些年，RNF213引起关注主要是因为研究发现RNF213是东亚人群烟雾病的易感基因，尤其是日本人；后期的研究还发现该基因位点突变p.R4810K还与亚洲人群颅内大动脉狭窄有关；欧洲的一项研究发现RNF213不同位点突变还与高加索人动脉瘤相关。RNF213基因可能与多种脑血管的发病机制相关。

RNF213 p.R4810K与烟雾病相关存在明显种族差异，主要集中在亚洲人，日本烟雾病病人该位点突变率为90.1％，韩国78.9％，中国23.1％；正常人也存在该位点的变异，日本人2.5％，韩国人2.7％，中国人0.9％。相对于日本及韩国，中国汉族烟雾病病人此突变位点突变率较低。高加索人烟雾病发病率是日本人的1/10，高加索人未发现RNF213 p.R4810K与烟雾病明显相关，这可能是高加索人烟雾病发病率较低的原因之一。在RNF213 p.R4810K与相同环境不同血统烟雾病病人的研究中发现，p.R4810K在56％亚洲血统烟雾病病人中存在，非亚洲血统烟雾病病人中无p.R4810K点突变。这提示RNF213 p.R4810K是否参与烟雾病的发病机制存在种族差异。

在转化医学的研究中，斑马鱼rnf213基因knockdown出现部分血管芽生，类似烟雾病的血管芽生；利用cre-loxp系统敲除小鼠Rnf213基因32号外显子未模拟烟雾病的表型；对应人RNF213c.14429G>A点突变小鼠也未模拟烟雾病的表型。RNF213是否参与了烟雾病的发病机制尚存在争议。

近些年发现利用morpholino技术敲减相关基因容易出现表型，但表型在突变体中并不能重复，研究表明morpholino技术容易出现脱靶敲除其他基因从而造成表型特异性较差。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供利用TALEN技术完整敲除斑马鱼rnf213a基因，设计的靶点为斑马鱼rnf213a的2号外显子，并且通过外交3代再内交形成纯合子斑马鱼。通过观察纯合子突变体的表型，可避免注射及morpholino脱靶引起的假表型，增加表型的特异性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种RNF213基因完整敲除纯合子斑马鱼的制备方法，包括以下步骤：

S1、设计针对斑马鱼RNF213基因2号外显子靶序列的TALEN序列；

S2、构建TALEN左、右臂质粒，并分别体外转录出TALEN左、右臂mRNA；

S3、将TALEN左、右臂mRNA混合并注射到转基因斑马鱼胚胎中，提取胚胎DNA测序发现TALEN的mRNA能作用于rnf213a基因2号外显子；

S4、将注射后的胚胎培养至F0代，并与野生型成鱼交配，获得F1代成鱼；