[发明专利]一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法

权利要求书

1.一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法，包括以下步骤：

(1)通过体内和体外实验验证组蛋白是否具有调控Wnt信号通路的靶基因的作用；

(2)通过CHIP-seq分析在ESCs、PGCs和SSCs三个过程所述组蛋白是否在靶基因的启动子区差异性富集；

(3)检测所述组蛋白甲基化与去甲基化是否影响靶基因对Wnt信号通路的响应；

(4)检测所述组蛋白去甲基化修饰酶对β-Catenin与受组蛋白调控的Wnt信号的转录因子在靶基因启动子结合位点的结合能力的影响，以研究是否存在组蛋白去甲基化修饰酶与Wnt信号转录因子之间的竞争结合关系；

根据步骤(1)～(4)的结果判断在ESCs向PGCs分化过程中，Wnt信号通路联合所述组蛋白作用于靶基因的作用机制。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述体外实验的方法，包括以下步骤：

A1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；

A2、将组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体分别侵染ESCs，侵染48h后以BMP4诱导ESCs向PGCs分化，收集诱导2d、4d、6d后的细胞，检测收集的细胞中的基因表达情况。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述体内实验的方法，包括以下步骤：

B1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；

B2、分别将组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体转入至孵化48～58h的早期胚胎中，继续孵化4.5d后，测定胚胎的生殖组织中靶基因的表达变化。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，若步骤(2)的结果为所述组蛋白在ESCs、PGCs和SSCs三个过程中能在靶基因的启动区差异性富集，则检测组蛋白甲基化以及去甲基化对靶基因启动子区的影响，其方法包括以下步骤：

C1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；

C2、在PGCs中分别转染组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体后，利用CHIP-qPCR检测靶基因启动子区组蛋白甲基化状态的变化。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述检测方法包括以下步骤：

D1、构建β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体、靶基因启动子全长载体、组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体

D2、将β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体和靶基因启动子全长载体共转染至DF1细胞，得到共转染后的细胞；

D3、向所述共转染后的细胞中分别转入组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体或组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体，通过双荧光素酶报告基因检测靶基因的启动活性。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测方法还包括以下步骤：

E1、构建β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体、靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体、组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；

E2、将β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体和靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体共转染至DF1细胞，得到共转染后的细胞；

E3、向共转染后的细胞中分别转入组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体或组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体，通过双荧光素酶报告基因检测靶基因的启动活性。