[发明专利]咖啡愈伤组织的悬浮培养方法

说明书

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及咖啡愈伤组织的悬浮培养方法。本发明所述方法将咖啡胚性愈伤组织接种至悬浮培养基中进行悬浮起始培养；然后取所述悬浮起始培养后的新生细胞团，以0.03～0.04ml新生细胞团/1ml液体培养基的浓度接种至所述悬浮培养基中进行继代增殖培养。本发明选择特定的悬浮培养基结合特定的继代起始浓度对咖啡愈伤组织进行悬浮培养，悬浮增殖率较高，且悬浮细胞的胚性活力保持良好。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及咖啡愈伤组织的悬浮培养方法。

背景技术

咖啡(Coffea ssp.)为茜草科咖啡属多年生常绿灌木或小乔木，与可可、茶并称为世界三大饮料作物，在世界热带农业经济、国际贸易及人们生活中占有重要地位，也是我国主要热带经济作物。

生产上咖啡栽培种主要包括中粒种(C.arabica)和小粒种(C.canaphara)。中粒种咖啡为异花授粉植物，通过种子繁殖会发生性状分离，子代不能保留亲本的优良性状。小粒种咖啡为自花授粉植物，经过多世代选育的纯系品种可通过种子繁殖，但常规纯系品种需经过多世代回交纯化，周期太长，育种效率低下。目前，杂交育种，特别是F1代杂交选育种已成为小粒种咖啡品种选育的趋势，而杂交品种必须通过无性繁殖才能保留杂交亲本的优良性状。目前，咖啡生产上主要通过嫁接、扦插等进行无性繁殖，且嫁接、扦插所用接穗和插条必须为长势旺盛的直生枝条，而每株咖啡树生长的直生枝数量很少，使大规模种苗生产受到限制，远远满足不了生产需要，优良咖啡品种不能得以大面积推广。

相较嫁接、扦插等传统无性繁殖方式，组织培养在高通量无性繁殖方面具有无可比拟的优势。咖啡组织培养主要通过体细胞胚胎发生方式进行，利用外植体先诱导出初级愈伤组织，在此基础上诱导胚性愈伤组织，再以胚性愈伤组织为材料诱导体细胞胚。目前，咖啡胚性愈伤组织诱导周期较长，从初级愈伤组织诱导出胚性愈伤组织一般需要半年以上时间，且部分咖啡品种胚性愈伤组织诱导率较低，通过胚性愈伤组织悬浮培养增殖，提高胚性愈伤组织得率是提高咖啡体胚发生组织培养种苗繁殖效率的有效手段。

1977年，Sondahl等建立了咖啡间接体胚发生体系，使咖啡体胚发生效率大大提高，但仍面临胚性愈伤诱导、增殖效率较低等问题，影响咖啡体胚发生种苗繁育效率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种咖啡愈伤组织的悬浮培养方法，使得该方法具有较高的悬浮增殖率，且获得的悬浮细胞可保持较高的胚性活力。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

咖啡愈伤组织的悬浮培养方法，包括：

将咖啡胚性愈伤组织接种至悬浮培养基中进行悬浮起始培养；所述悬浮培养基由以下组分组成：50％ MS大量元素、50％ MS微量元素、50％ MS铁盐、10mg/L半胱氨酸、5mg/L维生素B1、1mg/L尼克酰胺酸、1mg/L维生素B6、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白、200mg/L麦芽提取物、1.5mg/L2,4-D、1.5mg/L KT、15mg/L蔗糖，pH值为5.6～5.8；

取所述悬浮起始培养后的新生细胞团，以0.03～0.04ml新生细胞团/1ml液体培养基的浓度接种至所述悬浮培养基中进行继代增殖培养。

一些实施方案中，所述咖啡愈伤组织为由咖啡叶片诱导获得的胚性愈伤组织。

本发明所述的咖啡愈伤组织，以中粒咖啡或小粒咖啡为材料，根据Sondahl的方法诱导获得。其中，中粒种与小粒种分别于2～4个月和5～8个月后诱导出胚性愈伤组织(如图1所示)。

本发明中，优选疏松易分离、富含细小球形胚，且发育时间不超过4周的咖啡愈伤组织进行悬浮培养。

一些具体实施例中，所述悬浮培养基由以下组分组成：