[发明专利]一种生产质粒的方法

说明书

本发明涉及生产质粒的方法，所述方法包括在添加有固体培养基的液体培养基中培养含有质粒的大肠杆菌。该方法可以提高细菌生长密度2‑4倍，从而从相同体积的菌液中获得2‑4倍的质粒产量。

技术领域

本发明涉及一种生产质粒的方法，特别是通过培养大肠杆菌生产质粒的方法。

背景技术

质粒是能在细胞内独立复制的非基因组遗传物质，其携带的基因在塑造宿主细胞的某些特性时非常重要，比如携带抗生素抗性基因的质粒可以使宿主获得对相应抗生素的抵抗能力。在对生物进行工程改造时，用质粒的方式将外源DNA导入细胞中是最常用的改造方法。因此如何获得目标质粒，尤其是高通量地获得足量的质粒是一种现实需求。

在大肠杆菌中，通常质粒的产量与3个因素相关：1)质粒的拷贝数；2)质粒的长度；3)菌体的密度。质粒在一个细胞内的数量即其拷贝数与质粒的复制子种类相关，基于pUC19质粒的复制子，其拷贝数能够达到200个，而基于pBR322质粒的复制子，拷贝数一般在40个左右；基于F1因子复制子的质粒，则在细胞内一般就只有1-2个拷贝。所以质粒的拷贝数可以极大地影响质粒的产量。在质粒的复制子确定的情况下，质粒的产量与质粒的长度、菌体的密度都是线性相关的。在质粒的序列确定的情况下，提高菌体密度和增加培养液体积是仅有的两个选择。

培养大肠杆菌的液体容器有三角瓶、试管、384孔深孔板、96孔深孔板、48孔深孔板等。三角瓶的摇菌体积在10ml-1000ml之间，对于单个质粒需求量很大时适用；试管的摇菌体积在0.5ml-10ml之间，其获得的质粒量可以满足大部分下游需求；而深孔板是为高通量细菌培养开发的，其摇菌体积在0.01ml-1ml之间，获得的质粒仅能满足少量下游操作。

菌体的生长密度一般来说与生长环境密切相关，因素包括温度、氧气含量、pH值、培养基组成等。LB培养基是培养大肠杆菌时最常使用的，其组成是酵母浸出膏、胰蛋白胨和氯化钠，这是一种营养丰富的培养基，可以用于绝大多数场合下的细菌培养，包括质粒提取和蛋白表达。SOB培养基在LB培养基的基础上增加了胰蛋白胨的用量和镁离子，相对LB培养基来说，可以提高菌体密度约60％；而SOC培养基在SOB培养基的基础上又添加了葡萄糖，营养更加丰富。不过添加镁离子和葡萄糖都为培养基的灭菌操作带来了额外的麻烦，镁离子在121度高温高压灭菌时容易产生沉淀，葡萄糖在高温下也容易分解产生有害物质，因此都需要额外添加，或者选择特殊的灭菌方法，导致这两种培养基没有得到普遍使用。还有一些培养基用到了磷酸作为缓冲液，经过测试，稳定性难以达到要求。

发明内容

本发明通过在液体培养基中添加固体培养基的方法，可以使菌体密度提高2-4倍。从而将质粒的产量提高2-4倍。这使得用深孔板摇菌提取的质粒的量也能满足大部分下游应用的需求。实现了高通量获取中高产量质粒的目的。

本申请的一方面提供一种生产质粒的方法，其是一种高通量的在大肠杆菌中获得中高产量质粒的方法，所述方法包括用加入固体培养基的液体培养基培养含质粒的大肠杆菌。

在该方法中，在液体培养基中加入一定比例的固体培养基，固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，而液体培养基中的一些代谢废物可以扩散到固体培养基中，从而有效地提高菌体密度，增加质粒产量。

在一些实施方案中，所述的液体培养基包括但不限于LB液体培养基、SOC液体培养基、2X YT液体培养基和TB液体培养基等，特别是指LB液体培养基。

在一些实施方案中，所述的固体培养基，是指含有琼脂的培养基，其琼脂的含量在0.5％-2％，特别是指0.7％-1％。

在一些实施方案中，所述固体培养基，其成分中除了琼脂，还含有1％-4.5％的酵母浸出膏，特别是含有2.5％的酵母浸出膏。

在一些实施方案中，所述固体培养基，其成分中除了琼脂，还含有1％-5％的胰蛋白胨，特别是含有3％的胰蛋白胨。