[发明专利]一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法

权利要求书

1.一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、提供捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及孵育形成在所述网状基体上的EpCAM抗体；

B、使分离自体液的有核细胞流过所述捕获筛，以使有核细胞中的肿瘤细胞结合至所述捕获筛上；

C、用甲醛将捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上；

D、依次采用PD-L1一抗溶液、标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液、pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液、CD45一抗溶液及标记有荧光基团AlexaFluor 568的二抗溶液对所述捕获筛上固定的细胞进行孵育，然后用细胞核荧光染料标记出所述捕获筛上的所有细胞。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A中，所述网状基体包括不锈钢体以及覆盖于所述不锈钢体表面的保护层，所述保护层由贵金属或其合金制成，所述EpCAM抗体覆设于所述保护层上。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述EpCAM抗体通过traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接于所述保护层上。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述网状基体的尺寸为2-10 mm×2-10 mm，所述筛的孔为20 µm-100 µm。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤B中，在有核细胞流过所述捕获筛且肿瘤细胞结合至所述捕获筛上后，使用细胞清洗液冲洗所述捕获筛以去除没有结合至所述捕获筛的杂物或细胞。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤B中，所述有核细胞分离自血液、尿液或腹腔液。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤C中，将结合有肿瘤细胞的捕获筛放入4%多聚甲醛溶液中，室温固定10~60min，使用磷酸盐缓冲液清洗。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤D中的孵育具体实施如下：

加入PD-L1一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80 min，然后使用磷酸盐缓冲液清洗；

加入标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液，室温孵育20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；

加入pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；

加入CD45一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80 min，使用磷酸盐缓冲液清洗；

加入标记有荧光基团AlexaFluor 568的二抗溶液，室温孵育20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤D中，用细胞核荧光染料DAPI标记出所述捕获筛上的所有有核细胞。

10.根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括如下步骤：

E、采用CY5、FITC、PE和DAPI的滤光片通过高通量多色成像分析，观察通道表面荧光颜色，对肿瘤细胞表面标志分子PD-L1进行检测。