[发明专利]一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法

说明书

本发明公开了一种肿瘤细胞表面标志分子PD‑L1的检测方法，其提高了检测的准确性。一种肿瘤细胞表面标志分子PD‑L1的检测方法，包括如下步骤：A、提供捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及孵育形成在所述网状基体上的EpCAM抗体；B、使分离自体液的有核细胞流过所述捕获筛，以使有核细胞中的肿瘤细胞结合至所述捕获筛上；C、用甲醛将捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上；D、依次采用PD‑L1一抗溶液、标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD‑L1二抗溶液、pan‑CK‑AlexaFluor488一抗溶液、CD45一抗溶液及标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液对所述捕获筛上固定的细胞进行孵育，然后用细胞核荧光染料标记出所述捕获筛上的所有细胞。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法。

背景技术

程序性死亡受体-1(PD-1)是主要的免疫检查点受体，通过结合其配体程序性死亡配体-1(PD-L1)，使T细胞效应功能的下调，从而有助于维持对肿瘤细胞的耐受性。目前市场上针对PD-1和PD-L1的抑制剂主要有三种，pembrolizumab(商品名：Keytruda)、Nibolumab(商品名：Opdivo)和Atezolizumab(商品名：Tecentriq)，可用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等多种癌症的治疗。但是，并不是所有患者都能从PD-1/PD-L1抑制剂治疗过程中受益，PD-1/PD-L1抑制剂目前只在少部分的癌症病人身上可以产生持久控制肿瘤的效果。因此，检测病人是否有PD-L1阳性表达，能够有效帮助病人选择合适的药物用于治疗。目前，PD-1/PD-L1的检测方法主要是基于细胞蛋白水平的检测，在临床中，主要采用免疫组化的方法，利用手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行切片染色。免疫组化的结果与病理医师的经验密切相关。因此，我们迫切需要一种新的无创的、评价方法和标准较为稳定的PD-L1检测方法。

其中，循环肿瘤细胞是由原发灶脱落，进入血循环后，在远处器官或原发脏器定居，形成转移灶。循环肿瘤细胞CTC检测作为液体活检的热门领域，在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现已逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著。因此，若能提供一种检测循环肿瘤细胞等肿瘤细胞表面PD-L1的方法，将具有非常重要的意义。

中国专利CN201810312287.X即公开了一种循环肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法。其包括以下步骤：(1)将全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，并用甲醛进行固定；(2)先通过肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-CK进行阳性筛选，用PDL1-抗孵育所有细胞，然后用标记有FITC荧光基团的PD-L1二抗孵育，再用细胞核荧光染料DAPI 标记出所有细胞；(3)采用高通量多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，最终实现对循环肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测。这种检测方法采用全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，未能直接分离出CTC细胞，背景细胞复杂，难以保证检测的准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法，其提高了检测的准确性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法，包括如下步骤：

A、提供捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及孵育形成在所述网状基体上的EpCAM抗体；

B、使分离自体液的有核细胞流过所述捕获筛，以使有核细胞中的肿瘤细胞结合至所述捕获筛上；

C、用甲醛将捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上；