[发明专利]一种碱性蛋白酶的工业化液体发酵方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，具体的讲涉及一种碱性蛋白酶的工业化液体发酵方法，包括如下步骤：①号种子培养：将菌种接入1500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升；②号种子培养：将①号种子按照10％的接种量接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升；培养条件与一级种子相同；然后进行发酵培养；本发明并优化了相应的发酵机制，该发酵机制，过程操作简便，培养条件温和，发酵酶活力在100000u/ml以上，降低了单位酶活的生产成本，大大满足了市场的需要。使碱性蛋白酶能够在洗涤剂、饲料、皮革制造等行业中得到更为广泛的应用。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体的讲涉及一种碱性蛋白酶的工业化液体发酵方法。

背景技术

碱性蛋白酶(AlkalineProtease)是一种最适PH为9-11的蛋白酶类，分子量26000-34000道尔顿，一般在PH5-10时较稳定。由于其活性中心含丝氨酸(Ser)，故属于丝氨酸蛋白酶。它不但能水解肽键，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的功能。广泛应用于洗涤剂、医疗、丝绸、制革等行业。

近年来，随着人们生活水平的提高以及环境保护的需要，含磷洗涤剂已基本被淘汰，取而代之的是各种加酶洗涤剂的大量应用。因洗涤剂的水溶液一般呈碱性，PH大约为9-11，故碱性蛋白酶已成为目前市场上使用最多的洗涤添加剂。它能大幅度提高洗涤去污能力，特别对奶渍、汗渍、血渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果。随着洗涤剂行业迅速发展，洗涤剂的用量增长迅速，市场对碱性蛋白酶的需求亦大幅度增加。

但是，目前市场上可产业化生产的碱性蛋白酶酶活力普遍较低，使得单位酶活力所对应的生产成本相对较高，这远远不能满足当前洗涤剂等行业的需求。如何提高碱性蛋白酶的酶活力，降低生产成本已成为现在最需要解决的问题。因此，使用改进发酵工艺，提高碱性蛋白酶酶活力对酶制剂工业具有非常广阔的开发潜力和应用前景。

发明内容

因此本发明提出一种碱性蛋白酶的工业化液体发酵方法

本发明的技术方案是这样实现的：一种碱性蛋白酶的工业化液体发酵方法，包括如下步骤：①号种子培养：将能生产碱性蛋白酶的菌种接入1500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床220转/分，培养温度36-38℃，培养时间6-15h；②号种子培养：将①号种子按照10％的接种量接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床220转/分，培养温度36-38℃，培养时间6-15h；培养条件与一级种子相同；然后进行发酵培养。

进一步地，所述发酵所用培养基为：发酵培养基g/L：酵母浸粉15-20、棉籽饼粉25-35、麦芽糊精90-110、柠檬酸钠1-5、氯化钙2-5、K2HPO415-20、pH自然、溶剂为水；发酵条件为：温度：30-40℃；转速：100～600r/min；通风量：1∶0.5～1∶2.5；溶氧维持在20～30％，发酵过程中自动流加氨水及20％(v/v)的盐酸，使发酵液pH值维持在7.0。

进一步地，所述发酵培养：将①号种子罐菌种以5-10％接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量V/V1:1-3,罐压0.05MPa,培养时间70-100h；

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；

pH值控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值值保持在7.0-7.5；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/ml-5mg/ml。

进一步地，所述补料培养基组成为：麦芽糊精45％，豆饼水解液4.0％，不足部分纯净水补足，pH78.0，123℃灭菌40min。