[发明专利]永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定

权利要求书

1.永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定，其特征在于包括以下步骤：

1)iheESCs细胞构建；

2)iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定。

2.如权利要求1所述永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定，其特征在于在步骤1)中，所述iheESCs细胞构建的具体方法为：

(1)将含有hTERT的目的质粒和慢病毒包装质粒共转染293T工具细胞，36～48h后收集病毒上清液；将上清液感染子宫内膜异位症病人的子宫内膜，24～48h后观察荧光，并提取RNA和蛋白质，通过qPCR及Western Blot检测发现hTERT表达表达明显升高，细胞形态无明显改变；

(2)通过不间断培养对照细胞和感染细胞，发现hTERT过表达后，细胞可多传代至35代，而对照细胞仅能传代至18代；以上数据说明成功过表达hTERT，并且细胞周期成功延长1倍，说明永生化细胞iheESCs构建成功。

3.如权利要求1所述永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定，其特征在于在步骤2)中，所述iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定具体方法为：

(1)通过CCK8增值实验检测，iheESCs细胞和对照细胞的增殖无明显差异；而Transwell实验表明iheESCs细胞和对照细胞的迁移、侵袭能力无明显改变；

(2)采用Western Blot检测发现子宫内膜的雌激素受体ERα和ERβ，孕激素受体PR以及Keratin、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表达为发生改变；免疫细胞化学结果表明，iheESCs和对照细胞的间质标志蛋白Vimentin表达明显，而上皮标志蛋白Keratin表达低，二者均具有明显的间质特征；

(3)采用10nM孕激素和10mMcAMP培养液诱导iheESCs蜕膜化，5～7d后，iheESCs细胞变成丰满圆润，通过qRT-PCR检测发现胰岛素样生长因子结合蛋白-1和催乳素表达明显升高，表明iheESCs的依然保持蜕膜化生理功能；

(4)通过CCK-8实验发现雌激素促进iheESCs细胞增殖，Transwell实验发现雌激素促进iheESCs的迁移、侵袭能力，说明iheESCs细胞具有完善的雌激素应激反应；qRT-PCR和Western Blot检测发现LPS诱导iheESCs的炎症反应，IL-1β和IL-6等炎症因子的表达显著升高，表示iheESCs的炎症反应功能保持正常；

(5)进一步验证iheESCs细胞的增长和致癌性，体外平板克隆群落形成实验提示其增殖和对照细胞移植，不具有子宫内膜癌细胞Ishikawa的恶性增殖的特征；体内裸鼠成瘤实验说明iheESCs不具有致癌能力。