[发明专利]永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定

说明书

永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定，涉及子宫内膜异位症。iheESCs细胞构建；iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定。构建的iheESCs细胞的细胞生长周期明显延长，其增殖速率、雌/孕激素受体、EMT标志蛋白等均未发生改变，同时蜕膜化诱导反应、雌激素和炎症反应均为发生改变，并且构建后的细胞不具有致瘤性。因此，构建的iheESCs细胞相比于普通的原代细胞具有明显的生命周期长、表型稳定、状态活性均更高的特点，可适用于子宫内膜异位症病理机制，子宫内膜容受性生理机制等研究，在临床实验、医学生物实验等均具有一定的适用性。

技术领域

本发明涉及子宫内膜异位症，尤其是涉及永生化人子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞(immortalized humanendometriosiseutopicstromalcells,iheESCs)构建及鉴定。

背景技术

子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)，简称内异症，是一种具有雌激素依赖和炎症反应特征的慢性妇科疾病，常伴随盆腔疼痛、月经异常、性交疼等，甚至引发不孕不育，严重影响妇女生理和心理健康，给家庭带来经济和精神负担。内异症是指具有生长功能的子宫内膜在子宫腔外的其他部位如卵巢、腹壁等生长繁殖的良性病变，其发病率高达6％～15％，同时其复发率达到6％～67％。内异症的发病涉及众多影响因素，其具体机制目前尚未揭示。普遍接受的观点是“经血逆流学说”，即子宫内膜随月经经血逆流到腹腔后，粘附并生长在腹腔等部位。因此，子宫内膜的状态和基因表型和子宫内膜异位症发生发展密切相关，而内异症病人来源的子宫内膜(在位内膜)的原代细胞常被用于研究内异症及内异症病人子宫内膜容受性下降导致不孕不育的病理机制。但是，子宫内膜原代细胞生命周期短，而且容易退分化，失去对激素、细胞因子等应激反应，因此构建生命周期长、功能形状稳定的细胞株对内异症的科学研究非常重要。

目前已有多篇专利专注于人子宫内膜细胞的培养：中国专利CN 2018112805372通过经血过滤分离出子宫内膜组织，并通过胶原酶消化提取子宫内膜细胞的方法；中国专利CN 2006100866851提出通过激素调控体内动物和体外细胞的方法，大规模获取和扩增子宫内膜细胞的方法；中国专利CN 2018101571959建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型与鉴定子宫内膜上皮细胞气液相培养模型。但是，现有的专利均仅关注与正常妇女的子宫内膜培养，而对内异症的子宫内膜细胞关注较少。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述不足，提供通过高表达人端粒酶(hTERT)构建永生化在位内膜间质细胞系，并验证其生长、迁移、侵袭及雌激素、炎症应激反应等功能，为内异症的发病机制研究和子宫内膜容受性的探索提供新的细胞来源，构建生命周期长且子宫内膜特征保持稳定细胞系的永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定方法。

本发明包括以下步骤：

1)iheESCs细胞构建；

在步骤1)中，所述iheESCs细胞构建的具体方法可为：

(1)将含有hTERT的目的质粒和慢病毒包装质粒(VSVG/PMDL/REV)共转染293T工具细胞，24～48h后收集病毒上清液；将上清液感染子宫内膜异位症病人的子宫内膜，24～48h后观察荧光，并提取RNA和蛋白质，通过qPCR及Western Blot检测发现hTERT表达表达明显升高，细胞形态无明显改变；

(2)通过不间断培养对照细胞和感染细胞，发现hTERT过表达后，细胞可多传代至35代，而对照细胞仅能传代至18代；以上数据说明成功过表达hTERT，并且细胞周期成功延长1倍，说明永生化细胞iheESCs构建成功；

2)iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定：

在步骤2)中，所述iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定具体方法可为：