[发明专利]一种悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法

权利要求书

1.一种悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含靶向KBM5细胞基因的sgRNA的重组表达载体；

(2)培养悬浮细胞KBM5；

(3)采用电穿孔瞬时转染法将步骤(1)获得的重组表达载体和phCas9质粒共转染步骤(2)获得的KBM5细胞；

(4)筛选阳性细胞；

(5)筛选单克隆细胞；

(6)对单克隆细胞进行鉴定；

(7)阳性单克隆细胞扩大培养及冻存。

2.根据权利要求1所述的悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中靶向KBM5细胞基因的sgRNA包括如SEQ ID No.1所示的正义链和SEQID No.2所示的反义链，所述载体为pU6表达质粒。

3.根据权利要求1或2所述的悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中还包括对所述重组表达载体的切割有效性进行鉴定。

4.根据权利要求1或2所述的悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中电穿孔瞬时转染法包括以下步骤：

A、培养KBM5细胞，使转染时细胞密度达到70-90％；

B、收集步骤A获得的KBM5细胞，离心弃上清，重悬细胞，取1.8×10⁶个细胞，离心弃上清；

C、分别取4.5ug含编辑KBM5细胞基因突变的sgRNA的表达质粒和phCas9质粒，得到质粒悬液，用PBS调整质粒悬液体积至90uL；

D、用步骤C获得的质粒悬液重悬步骤b获得的细胞沉淀，混匀；

E、在电转杯中加入3mLBuffer E，调节电转参数，将步骤D获得的质粒与细胞混合液进行电转；

F、电转枪插上配套的10μL的电转枪头吸取步骤E获得的电转液，不能有气泡，将电转枪插入电转杯中，按下按钮通电；

G、将步骤F获得的电击液放入培养箱中培养，再次吸取10μL取步骤E获得的电转液进行步骤F所述的电击操作，获得的电击液放入对应培养孔中培养，直至步骤E中电转液全部电击完成，混匀电击液，置于培养箱中培养。

5.根据权利要求4所述的悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤E中的电转参数为：电压1200～1350V，脉冲时间20～30ms，脉冲次数1～3次。

6.根据权利要求1或2所述的悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中使用G418进行阳性克隆筛选。

7.根据权利要求1或2所述的悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(5)中使用有限稀释法进行单细胞克隆筛选。

8.根据权利要求7所述的悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，所述有限稀释法进行单细胞克隆筛选包括以下步骤：

A、分别收集经G418筛选后的KBM5细胞，低速离心，弃上清，重悬细胞，并将细胞浓度调整为10⁵cells/mL，混匀；

B、将步骤A获得的细胞进行10倍稀释，调整细胞密度为10⁴cells/mL，然后再进行10倍稀释，调整细胞密度为10³cells/mL；

C、分别取步骤B获得的细胞悬液100μL，置于96孔培养板第一列孔中，使各个孔中的细胞数为100个，分别补加100μL的完全培养基，混匀，从第一列吸取100μL至第二列的孔中，以此类推，以列为单位进行稀释，最终稀释至每一列孔的细胞约为1个，最后每列孔再分别补加100μL完全培养基；

D、将步骤C获得的培养板放于培养箱内，用倒置显微镜观察克隆的生长情况，留下只有一个细胞克隆生长的孔，即为所述单细胞克隆。