[发明专利]一种悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法

说明书

本发明公开了一种悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，包括以下步骤：(1)构建含靶向KBM5细胞基因的sgRNA的重组表达载体；(2)培养悬浮细胞KBM5；(3)采用电穿孔瞬时转染法将步骤(1)获得的重组表达载体和phCas9质粒共转染步骤(2)获得的KBM5细胞；(4)筛选阳性细胞；(5)筛选单克隆细胞；(6)对单克隆细胞进行鉴定；(7)阳性单克隆细胞扩大培养及冻存。本发明方法通过优化的电转染方案，可使转染效率高于50％，能有效解决悬浮细胞的脂质体转染效率低、病毒转染有致突变性等问题，且具有操作简便、成本低和基因敲除稳定系的效率高等优点。

技术领域

本发明属于细胞生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法。

背景技术

针对悬浮细胞的基因编辑目前已有采用CRISPR/Cas9技术进行编辑的研究，但大多为对 K562、Jurkat T细胞的基因进行编辑，而且具体过程多种多样。其中单就细胞转染方法上有利用脂质体、病毒感染和电穿孔转染等多种方法。在细胞抗性筛选上也有利用G418或者嘌呤霉素的差异，此外筛选浓度与时间也各有不同。另外，在在克隆化方法上也存在半固体培养法、流式细胞分选法及有限稀释克隆法多种选择。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到 CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。 CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白再与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single-guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。

现有的细胞系构建方法包括利用电穿孔结合流式细胞分选技术构建细胞系，采用电转、嘌呤霉素筛选与有限稀释法构建细胞系，以及通过病毒感染、流式分选构建悬浮细胞基因编辑稳定细胞系。而针对KBM5细胞的研究目前多是采用siRNA干扰技术，有研究利用CRIPSR/Cas9技术通过电穿孔转染结合流式细胞分选法对其进行基因编辑筛选点突变细胞，但效率仅有1％左右。针对KBM5细胞的基因编辑构建稳定细胞系的研究很少，且普遍存在安全性、免疫排斥和阳性克隆效率低等问题。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，能有效解决现有技术存在的安全性、免疫排斥和阳性克隆效率低等问题，具有转染效率高、操作简便、成本低和基因敲除稳定系的效率高等优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含靶向KBM5细胞基因的sgRNA的重组表达载体；

(2)培养悬浮细胞KBM5；

(3)采用电穿孔瞬时转染法将步骤(1)获得的重组表达载体和phCas9质粒共转染步骤 (2)获得的KBM5细胞；

(4)筛选阳性细胞；

(5)筛选单克隆细胞；

(6)对单克隆细胞进行鉴定；

(7)阳性单克隆细胞扩大培养及冻存。

优选地，所述步骤(1)中靶向KBM5细胞基因的sgRNA包括如SEQ ID No.1所示的正义链和SEQ ID No.2所示的反义链，所述载体为pU6表达质粒。