[发明专利]GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种GLUT4基因敲除的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA基于CRISPR/CAS9系统，且所述sgRNA在GLUT4基因上的靶序列位于其3号外显子上，靶序列如SEQ ID NO：1所示，所述sgRNA对应的双链gDNA序列如SEQ ID NO:2-3所示。

2.一种包含权利要求1所述的sgRNA的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pX458-GLUT4，所述表达载体pX458-GLUT4的构建方法为：

在GLUT4基因的3号外显子上的靶序列的5’端加上BbsI的酶切位点caccg，构成序列SEQID NO：2，并人工合成其互补序列SEQ ID NO：3，将互补序列SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO：3所形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，从而制得表达载体pX458-GLUT4。

4.权利要求3所述的表达载体在制备GLUT4基因敲除的A549细胞系中的应用。

5.一种GLUT4基因敲除的A549细胞系，其特征在于，其构建方法为：以权利要求3中所述的表达载体pX458-GLUT4作为GLUT4基因的打靶载体，转染A549细胞，获得GLUT4基因敲除的单克隆细胞株，命名为G3-6。

6.如权利要求5所述的一种GLUT4基因敲除的A549细胞系，其特征在于，所述构建方法具体包括如下步骤：

S1、培养A549细胞至70～90％汇合度时，将含有表达载体pX458-GLUT4的混合液转染进A549细胞中并培养；

S2、待细胞数目长满后提取细胞基因组并进行PCR鉴定；

S3、将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对，确定G3-6为突变体；

S4、用蛋白质免疫印迹进一步验证确定G3-6是GLUT4基因缺陷型。

7.如权利要求6所述的一种GLUT4基因敲除的A549细胞系，其特征在于，所述步骤S2中PCR鉴定所用的上游引物、下游引物分别为SEQ ID NO： 4和SEQ ID NO：5所示。

8.权利要求5所述的GLUT4基因敲除的A549细胞系在研究GLUT4基因表达缺失对A549细胞葡萄糖摄取及细胞功能上的应用。