[发明专利]GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法

说明书

本发明提供了一种GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法。本发明提供的GLUT4基因敲除的sgRNA，在GLUT4基因上的靶序列位于其3号外显子上，靶序列如SEQ ID NO：1所示；本发明还提供了GLUT4基因敲除的A549细胞系以及构建方法，以表达载体pX458‑GLUT4作为GLUT4基因的打靶载体，转染A549细胞，获得GLUT4基因敲除的单克隆细胞株；本发明利用CRISPR/Cas9系统从A549细胞中敲除GLUT4基因，从基因和蛋白水平的检测都证实，GLUT4已被成功敲除，为研究GLUT4基因表达缺失对A549细胞葡糖糖摄取及细胞功能上的提供了理想的细胞模型。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法及其应用。

背景技术

A549细胞是一种人肺腺癌上皮细胞系。它在形态、结构及代谢产物组成上与二型肺泡细胞极为相似，后者是一类与直径约9微米的球形肺泡细胞，主要功能为合成和分泌一些脂蛋白类活性物质，降低肺泡气液界面的表面张力，从而增加肺泡稳定性，防止水肿。因此，A549细胞已被用作研究二型肺泡细胞反应的模型。另一方面，它作为非小细胞肺癌中的一种，在肺癌研究中具有一定的意义。众所周知，癌细胞拥有着不受控的无限增殖及持续的侵袭与迁移的能力，而这些过程势必需要其发生倍比于正常细胞的能量代谢及糖代谢。

GLUT4是一种膜蛋白，分子量约45-55KD，基本结果有12个跨膜片段(M1-M12)组成。人类与大鼠GLUT4约有95％以上的核苷酸序列是相同的。GLUT4仅存在于胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中。在没有胰岛素刺激时主要位于细胞内的贮存囊泡内。当胰岛素与受体结合后，激发一系列级联效应，导致富含GLUT4的囊泡向细胞外膜移动，囊泡膜与细胞外膜融合，GLUT4转位至细胞外膜且活性最佳，与葡萄糖结合并发生结构改变，将葡萄糖转运至细胞内后恢复原来的结构。这一过程很容易被逆转，当循环胰岛素水平下降时，GLUT4通过吞饮作用从细胞外膜清除并回到贮存囊泡中。由此胰岛素敏感组织可迅速对循环胰岛素水平做出反应，保持血糖平衡。啮齿类动物及人类在胰岛素抵抗状态下，GLU4的表达显示的组织特异性调节，即在脂肪细胞中表达下降，但在骨骼肌中则被保护。

然而GLUT4基因表达缺失是否会对A549细胞葡糖糖摄取及细胞功能上产生影响，目前还未有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的研究空白，提供GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法。

为实现上述目的，本发明通过以下方案实现：

在本发明的第一方面，提供了一种GLUT4基因敲除的sgRNA，所述sgRNA基于CRISPR/CAS9系统，且所述sgRNA在GLUT4基因上的靶序列位于其3号外显子上，靶序列如SEQID NO：1所示。

在本发明的第二方面，提供了包含所述的sgRNA的表达载体。

优选地，所述表达载体为pX458-GLUT4。

具体地，所述表达载体pX458-GLUT4的构建方法为：

在GLUT4基因的3号外显子上的靶序列的5’端加上BbsI的酶切位点caccg，构成序列SEQ ID NO：2，并人工合成其互补序列SEQ ID NO：3，将互补序列SEQ ID NO.2和SEQ IDNO：3所形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，从而制得表达载体pX458-GLUT4。

在本发明的第三方面，提供了所述的表达载体在制备GLUT4基因敲除的A549细胞系中的应用。

在本发明的第四方面，提供了GLUT4基因敲除的A549细胞系。