[发明专利]一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体：将RHDV结构蛋白VP60插入复合启动子的下游，将IL-18基因插入串联启动子的下游，构建了含有RHDV结构蛋白VP60和IL-18的鸡痘病毒中间转移载体；

步骤二，制备CEF单层细胞：取9-11日龄无特定病原体鸡胚，分别用碘酒、酒精棉对鸡胚进行擦拭消毒后放在超净台内，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子敲破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，再用心的无菌镊子接开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入蛋壳内取出鸡胚后放入平皿中，去头、四肢、内脏，剪碎成小块，再用PBS清洗3遍，至组织款发白为止，将剪碎的组织小块移入另一小平皿内，加入适量的胰酶和磷酸盐缓冲液，于37℃细胞培养箱中消化10分钟左右，倒掉液体后加入生长液，用枪头反复吹成单个细胞，再用灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬液稀释10倍，使细胞终止浓度到达50万个/ml，每个细胞瓶中加入8ml，放入二氧化碳培养箱中，将培养至CEF细胞长成融合单层，待用；

步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组：取新制备的生长状态良好的CEF细胞，倒掉其中的培养液，清洗并且加入胰酶，静置至壁上细胞全部消化下来，倾去并洗去残留胰酶，选择融合度为70～80％的融合单层CEF细胞，吸去培养上清液，然后按0.1moL接种FPV 282E4株，吸附，在鸡痘病毒吸附培养的同时，向85μL的MEM完全培养液中加入15μL DOTAP Liposomal，轻轻混匀，得到前混合物，另取50mL MEM完全培养液加入10～20μg鸡痘病毒中间转移载体并且混匀，得到后混合物，然后将后混合物滴加于前混合物中轻轻吹打混匀，待鸡痘病毒吸附1.5～3h后，将质粒与转染试剂的混合液加到上述单层细胞上，并用无血清MEM完全培养液将每孔中的液体补足至1mL，培养12～18h，然后每孔补加MEM完全培养液，继续培养72～120h收病毒，-70℃保存；

步骤四，鸡痘病毒的筛选：向MEM完全培养液中加入BrdU，10～14小时后吸去MEM完全培养液，接种步骤三得到的病毒，再用含BrdU的培养液将每孔中的液体补足至3ml，接种病毒后120h收获细胞，将收获细胞接种于BrdU预处理后的CEF单层细胞上，继续培养120h，收获细胞，经过三次BrdU加压筛选后，将收获的细胞再接种于CEF单层细胞上，在无BrdU的条件下培养，挑选单个病毒蚀斑，并进行三次蚀斑纯化、扩增，再筛选重组病毒。

2.根据权利要求1所述的重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤二中采用Hankˊs液洗融合单层，步骤三中用1mL质量分数为0.25％的胰酶洗一次，然后再加入0.5mL质量分数为0.25％的胰酶。

3.根据权利要求1所述的重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤三中吸附和培养的条件均为37℃并且混合气氛中CO₂的体积分数为5％。

4.根据权利要求1所述的重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤四中将收获细胞冻融3次后，再接种于BrdU预处理后的CEF单层细胞上。

5.根据权利要求1或4所述的重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤四中筛选重组病毒的方法包括间接免疫荧光实验和Western blotting检测。

6.根据权利要求1或2所述的重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述骤二中添加MEM完全培养液并且继续培养24～48h的培养条件为37℃，湿度为60～80％，混合气氛中CO₂的体积分数为5％，MEM完全培养液中甲基纤维素的质量分数为1％，小牛血清的质量分数为4％。