[发明专利]一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，要解决的是现有治疗RHD的疫苗中存在的问题。本发明具体步骤如下：步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体；步骤二，制备CEF单层细胞；步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组；步骤四，鸡痘病毒的筛选。本发明应用基因重组技术，构建含有IL‑18的重组鸡痘疫苗，再经过加压筛选、鉴定、培养、浓缩后的毒力测定，免疫原性的检测，具有易培养、易储存、无毒性扩散、易生产、提高免疫效果、节省资金等优点，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及兔出血症治疗领域，具体是一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法。

背景技术

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbithemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种急性、高度传染性、高致死性的疾病，以呼吸系统出血、实质器官水肿、淤血及出血变化为特征，给养兔业带来巨大的经济损失，曾是兔的一种毁灭性传染病而备受关注。该病于1984年在我国江苏省的江阴县首次被发现，之后迅速蔓延至全国25个省、市、自治区。迄今亚洲的朝鲜、印度和黎巴嫩、美洲的墨西哥、非洲的喀麦隆和欧洲的奥地利、比利时、捷克、丹麦、法国、德国、希腊、卢森堡、荷兰、波兰、西班牙、瑞典、瑞士及南斯拉夫等国也都有发生。该病常呈暴发性流行，发病率及病死率极高，对易感动物致病率达90％，病死率高达100％，是危害养兔业的最严重的疾病之一。

对RHDV感染至今尚无有效治疗药物，所能应用的治疗措施仅限于对症治疗和支持治疗。目前，各国都加大了RHDV疫苗的研究力度，以便能够对RHDV感染进行有效的预防和治疗。使用的组织灭活疫苗预防该病，但存在着散毒、生产成本不断增加等潜在的缺点以及动物福利等问题，使得研究人员致力于基因工程疫苗的研制以达到预防该病的效果。

现在的RHDV疫苗制备主要以RHDV病毒接种家兔后，分离肝脏，研磨过滤灭菌后，但是病毒的体外培养仍是难题,还没有找到合适的体外培养细胞，有使用期限，过期后疫苗失效。现仍用该病死兔的肝脏制灭活苗,因灭活不彻底有导致散毒可能,故有必要在病毒结构和体外易感细胞上突破,研制基因疫苗是当下乃至将来的发展趋势。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，具体步骤如下：

步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体：将RHDV结构蛋白VP60插入复合启动子的下游，将IL-18基因插入串联启动子的下游，构建了含有RHDV结构蛋白VP60和IL-18的鸡痘病毒中间转移载体。

步骤二，制备CEF单层细胞：取9-11日龄无特定病原体鸡胚，分别用碘酒、酒精棉对鸡胚进行擦拭消毒后放在超净台内，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子敲破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，再用心的无菌镊子接开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入蛋壳内取出鸡胚后放入平皿中，去头、四肢、内脏，剪碎成小块，再用PBS清洗3遍，至组织款发白为止。将剪碎的组织小块移入另一小平皿内，加入适量的胰酶(0.5％)和磷酸盐缓冲液，于37℃细胞培养箱中消化10分钟左右，倒掉液体后加入生长液，用枪头反复吹成单个细胞，再用灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬液稀释10倍，使细胞终止浓度到达50万个/ml，每个细胞瓶中加入8ml，放入二氧化碳培养箱中，将培养至CEF(胚胎成纤维细胞)细胞长成融合单层，待用。