[发明专利]一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法

权利要求书

1.一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法，其特征在于：包括材料选择、初始接种和悬浮培养工序，将在培养基Ⅰ中培养获得的生长快、活力旺盛的胚性愈伤作为培养材料，然后将在培养基Ⅱ中通过二次振荡培养获取的胚性培养物置于培养基Ⅲ中进行悬浮培养，最后获得马尾松悬浮胚性细胞；主要操作步骤如下：

（1）材料选择：

将按常规方法培养获得的马尾松胚性愈伤转入培养基Ⅰ中培养7～10 d，挑选体积增大2倍以上、颜色纯白，且无水渍、褐化的胚性愈伤作为培养材料；

所述的培养基Ⅰ为：改良DCR培养基 + 2,4-D 0.6 mg·L^-1 + NAA 1.0 mg·L^-1 + Meta-Topolin（MT）0.5 mg·L^-1+ 肌醇 200 mg·L^-1 + 谷氨酰胺 500 mg·L^-1 + 酸水解酪蛋白500 mg·L^-1 + 硫代硫酸钠50 mg·L^-1 + 蔗糖10000 mg·L^-1 + 乳糖5000 mg·L^-1 + 木糖10000 mg·L^-1 +植物凝胶2000 mg·L^-1 + 250 mg·L^-1 MES；

（2）初始接种：

将2～3 g培养材料转入150 mL广口瓶中，往瓶中加入25 mL培养基Ⅱ，振荡培养10～14d，然后再往瓶中加入20 mL培养基Ⅱ，继续振荡培养7～10 d，获得胚性培养物；

所述的培养基Ⅱ为：改良DCR培养基 + 2,4-D 0.3 mg·L^-1 + NAA 1.0 mg·L^-1 + MT0.3 mg·L^-1+ 肌醇 100 mg·L^-1 + 谷氨酰胺 1000 mg·L^-1 + 天冬酰胺500 mg·L^-1 + 硫代硫酸钠50 mg·L^-1 + 蔗糖10000 mg·L^-1 +麦芽糖20000 mg·L^-1 +活性炭 250 mg·L^-1 +250 mg·L^-1 MES；

（3）悬浮培养：

将广口瓶中胚性培养物全部转入100 mL量筒进行沉积，去掉上清液，取5 mL沉积胚性细胞转入干净的广口瓶中，往瓶中加入40 mL培养基Ⅲ进行振荡培养7～14 d，停止振荡，在瓶中进行胚性细胞的沉积，弃上清液后取3～10 mL沉积胚性细胞和35～42 mL培养基Ⅲ转入干净的广口瓶中，进行胚性细胞的继代增殖悬浮振荡培养，培养周期7～10 d，获得马尾松悬浮胚性细胞；

所述的培养基Ⅲ为：改良DCR培养基 + NAA 1.0-2.0 mg·L^-1 + MT 0.4-0.8 mg·L^-1+ABA 0.2-0.4 mg·L^-1+ GA₃ 0.2-0.4 mg·L^-1 + 肌醇900 mg·L^-1 + 谷氨酰胺350 mg·L^-1 + 天冬酰胺1200 mg·L^-1 + 五氮杂胞苷1.0-2.0 mg·L^-1 + 麦芽糖30000 mg·L^-1 + 250mg·L^-1 MES；

以上所述的改良DCR培养基的组成为：KNO₃ 480 mg·L^-1；NH₄NO₃ 120 mg·L^-1；KH₂PO₄220 mg·L^-1；CaCl₂ 110 mg·L^-1；MgSO₄·7H₂O 180 mg·L^-1；MgCl₂·6H₂O 65 mg·L^-1；FeSO₄·7H₂O 15 mg·L^-1；Na₂EDTA 20 mg·L^-1；MnSO₄·H₂O 20.0 mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O43.0 mg·L^-1；CuSO₄·5H₂O 0.13 mg·L^-1；H₃BO₃ 15.5 mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O 0.02 mg·L^-1；KI 4.15 mg·L^-1；CoCl₂·6H₂O 0.03 mg·L^-1；维生素B₁ 0.5 mg·L^-1；维生素B₆ 1.0mg·L^-1；烟酸 1.0 mg·L^-1；甘氨酸2.0 mg·L^-1。