[发明专利]一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法

说明书

本发明公开了一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法，包括材料选择、初始接种和悬浮培养工序，将在培养基Ⅰ中培养获得的生长快、活力旺盛的胚性愈伤作为培养材料，然后将在培养基Ⅱ中通过二次振荡培养获取的胚性培养物置于培养基Ⅲ中进行悬浮培养，最后获得马尾松悬浮胚性细胞。本发明详细、系统地对悬浮增殖培养中的材料性状、初始接种量、接种密度、培养周期及培养条件等进行了明确的规定，实现了马尾松胚性愈伤悬浮培养体系的建立，并获取了大量的悬浮培养的胚性细胞系，为今后开展相关马尾松细胞与基因工程方面的研究提供了可靠的资源与技术保障。

技术领域

本发明属林木繁殖技术领域，涉及组织培养胚性愈伤悬浮培养技术，尤其是一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法。

背景技术

马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是我国南方生态建设和造林用材的主要树种。作为一种综合利用价值高、推广前景广阔的树种，马尾松不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。马尾松育种周期长，加之近年来随着种子园母树老化，结实量下降，良种匮乏，导致南方马尾松人工林遗传分化差异大、林分质量不高、生产力低下。为推动马尾松产业高效发展，实现优良品系无性育苗的良种产业化尤为关键。植物组培技术的使用，是实现良种育苗产业化的有效途径。在组培技术中相对于器官发生而言，体细胞胚胎发生作为植物细胞全能性的一种表达方式，是植物细胞工程中植株再生的重要手段，其具有增殖系数高，结构完整、遗传稳定及不受自然条件限制等诸多优势，在大规模无性繁殖、人工种子制备、种质保存及遗传转化等诸多领域均具有重大应用价值，是当前国际上进行林木无性快繁的主要手段。目前，马尾松体细胞胚胎发生已有相关研究，但在继代培养中受胚性愈伤组织活力的影响，增殖系数变化较大，后期再分化能力差异较大，繁育效果不稳定。此外，胚性愈伤组织作为一种优良的细胞工程与生物工程育种的繁殖材料，具有明显的优越性，但进行胚性细胞悬浮系的构建是进行细胞融合与分子遗传改良等方面研究的基础与保障。目前在马尾松胚性细胞悬浮系建立的方法研究中，多处于一种试验性摸索阶段，研究成效不显著，尚未达到实际生产性应用的水平。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种能获取大量悬浮培养的胚性细胞的马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法，实现了马尾松胚性愈伤悬浮细胞系的建立。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法，包括材料选择、初始接种和悬浮培养工序，将在培养基Ⅰ中培养获得的生长快、活力旺盛的胚性愈伤作为培养材料，然后将在培养基Ⅱ中通过二次振荡培养获取的胚性培养物置于培养基Ⅲ中进行悬浮培养，最后获得马尾松悬浮胚性细胞；主要操作步骤如下：

（1）材料选择：

将按常规方法培养获得的马尾松胚性愈伤转入培养基Ⅰ中培养7～10 d，挑选体积增大2倍以上、颜色纯白，且无水渍、褐化的胚性愈伤作为培养材料；

（2）初始接种：

将2～3 g培养材料转入150 mL广口瓶中，往瓶中加入25 mL培养基Ⅱ，振荡培养10～14 d，然后再往瓶中加入20 mL培养基Ⅱ，继续振荡培养7～10 d，获得胚性培养物；

（3）悬浮培养：

将广口瓶中胚性培养物全部转入100 mL量筒进行沉积，去掉上清液，取5 mL沉积胚性细胞转入干净的广口瓶中，往瓶中加入40 mL培养基Ⅲ进行振荡培养7～14 d，停止振荡，在瓶中进行胚性细胞的沉积，弃上清液后取3～10 mL沉积胚性细胞和35～42 mL培养基Ⅲ转入干净的广口瓶中，进行胚性细胞的继代增殖悬浮振荡培养，培养周期7～10 d，获得马尾松悬浮胚性细胞。