[发明专利]一种修饰的K562细胞、其制备方法及NK细胞培养组合物

说明书

本发明提供一种修饰的K562细胞、其制备方法及NK细胞培养组合物。所述修饰的K562细胞是通过将融合基因通过质粒进行基因重组至K562细胞的AAVS1转座子而得到的；其中，所述融合基因包括人源基因，其中所述人源基因包括mbIL15、4‑1BBL和mbIL21。所述修饰的K562细胞是通过使用位点特异性基因的整合技术开发的细胞系，通过其扩增的NK细胞具有较高的细胞活性、纯度、细胞毒性和扩增效率；具有极大的市场前景和经济价值。

本专利申请是申请号为201610340117.3、申请日为2016年5月20日、发明名称为“一种高效扩增冷冻保存NK细胞的方法及其应用”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种修饰的K562细胞、其制备方法、以及包含所述修饰的K562细胞的NK细胞培养组合物。

背景技术

人自然杀伤(NK)细胞是由表达CD56和缺乏CD3(CD-CD56+)的天然免疫系统的淋巴细胞组成的。NK细胞具有广谱的杀伤肿瘤细胞的功能，能够通过细胞毒性颗粒诸如穿孔素和颗粒酶，并通过如死亡受体相互作用，Fas-Fas配体结合和TNF相关的细胞凋亡诱导配体结合等机制发挥抗肿瘤作用。NK细胞还可以通过膜受体FcRγIII(CD16)介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。NK细胞的靶向识别和激活通过抑制和激活NK细胞表面受体和表达在靶细胞上的相关配体这个平衡来发挥作用，其允许对病原体入侵和恶变立即响应。这一独特的靶向识别NK细胞的机制不同于主要组织相容性复合体(MHC)限制性T细胞受体(TCR)的T细胞依赖性机制。因此，使用同种异体NK细胞来治疗癌症可能不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。

在健康受试者中，NK细胞大约占外周血单个核细胞(PBMC)的5-20％。在过继免疫治疗中，大剂量的NK细胞范围从5×10^6-5×10^7/kg体重每剂量，最多4剂量。现有技术中，能够从大量的外周血中富集扩增NK细胞的方法，多数是借助于使用侵入性白细胞分离和大型磁分离装置，这种方式十分昂贵，并对患者造成一定风险。另一种流行的NK细胞疗法是使用饲养细胞扩增NK细胞，如K562细胞修饰的膜结合分子，例如白介素(IL)-15和4-1BB配体(K562-mb15-41BBL)。这些饲养细胞可以迅速地从外周血单个核细胞扩增NK细胞，使NK细胞在第7天平均扩增21.6倍，第21天扩增277倍。但是，由于衰老导致的端粒酶缩短，所以会限制继续扩增。

获得大剂量NK细胞通常需要扩增数周，回输的NK细胞必须是新鲜的，细胞培养和多剂量细胞输注之间的协调是具有极大的挑战性的。因此，扩增后的NK细胞的冻存是非常有必要的。然而，传统的NK细胞的冻存对细胞具有有害的影响，如降低NK细胞活力，细胞毒性以及对功能至关重要的NK细胞受体的表达。通常NK细胞无法从冻存解冻后立即裂解癌细胞，复苏的NK细胞需要用IL-2刺激过夜以恢复冻存的NK细胞的细胞毒性(Denman,Senyukovet al.,2012；Lapteva N et al.,2012)。因此，现有技术中，细胞存活性仍然是一个问题，并且复苏后的NK细胞存活不能持续超过一周。同时，复苏的NK细胞能否进一步扩增仍然不明。因此，本领域目前非常需要一种新的保持NK细胞活性和原有功能并且具有很好的扩增性的冻存方法。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于，提出一种保持NK细胞活性，功能以及扩增性的冻存方法。

为解决上述技术问题，本发明公开了一种高效扩增冷冻保存NK细胞的方法，所述方法通过将融合基因通过质粒进行基因重组至AAVS1转座子，并在细胞扩增中间阶段引入冷冻/融化步骤至修饰K562细胞系为基础的NK细胞扩增步骤；最后进行NK细胞的扩增和保存。

优选的，所述融合基因为人染色体19编码mbIL15，4-1BBL和mbIL21。

优选的，所述融合基因的基因表达质粒骨架为pFastBac1。

优选的，所述质粒骨架的启动子为巨细胞病毒。