[发明专利]小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物及其扩增方法在审
| 申请号： | 201910621436.5 | 申请日： | 2019-07-10 |
| 公开（公告）号： | CN110283885A | 公开（公告）日： | 2019-09-27 |
| 发明（设计）人： | 朱志煌;林琪;何丽斌;周宸;吴建绍;仇登高;杨求华 | 申请（专利权）人： | 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12Q1/6888;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京挺立专利事务所(普通合伙) 11265 | 代理人： | 叶树明 |
| 地址： | 361000 *** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因全序列 小丑鱼 线粒体16S 扩增引物 碱基 扩增 单链寡核苷酸 反应条件 轻链引物 重链引物 分类 基因 进化 应用 研究 | ||
1.小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括轻链引物和重链引物：
所述轻链引物为Clownfish-16SrRNA-F，包括20个碱基，位于12S rRNA基因上；
所述重链引物为Clownfish-16SrRNA-R，包括20个碱基，位于tRNA-Leu基因上。
2.根据权利要求1所述的小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物，其特征在于，所述轻链引物的碱基序列为AAGGGGAGGCAAGTCGTAAC。
3.根据权利要求1所述的小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物，其特征在于，所述重链引物的碱基序列为TGTGTAAAGGGCTTAGGTCT。
4.小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括：
S1、获取小丑鱼待测样本，利用基因组抽提试剂盒提取待测样本的基因组DNA，通过琼脂糖电泳检测所提取的基因组DNA；
S2、将检测合格后的基因组DNA置于反应器中，所述反应器中包括dNTP，10×Taq DNA聚合酶Buffer，10μM的轻链引物Clownfish-16SrRNA-F和10μM的重链引物Clownfish-16SrRNA-R，Taq DNA聚合酶ddH2O；
S3、设定反应温度95℃预变性5min，然后95℃变性30s，接着55℃退火40s，72℃延伸100s，重复该操作356次，最后72℃延伸5min；
S4、将所得扩增引物通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测引物的大小和纯度。
5.根据权利要求4所述的小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物的扩增方法，其特征在于，所述S2反应器中的成分及含量包括：
6.根据权利要求4所述的小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物的扩增方法，其特征在于，S2中所述反应器包括Bio-Rad C1000TM Thermal Cycler仪器。
7.根据权利要求4所述的小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物的扩增方法，其特征在于，S4中所述检测过程包括：
S41、经凝胶回收纯化的PCR扩增产物在T4 DNA连接酶的作用下与pGEM-T载体进行连接反应；
S42、设定连接反应体系为载体1μl，T4 DNA连接酶1μl，连接Buffer 5ul，PCR纯化产物3μl，连接反应于冰上操作，反应液置于4℃冰箱，冷藏12h以上；
S43、提取DH5α感受态细胞，通过热激法进行转化，用含有氨苄抗生素(Amp)LB平板，所述平板在使用前预先均匀涂布40ul 20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和30ul 0.2mol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG))进行蓝白筛选，并通过菌液PCR扩增确认挑取的阳性克隆子；
S44、测序引物设定为SP6/T7，序列分析仪设定为ABI 3730全自动DNA测序仪，经测序及与GenBank中的同源序列进行比对，确认为包含线粒体16S rRNA基因全序列、tRNA-Val全序列及长度为36bp左右的12S rRNA基因3’端部分序列的扩增产物。
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