[发明专利]小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物及其扩增方法

说明书

本发明公开了小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为Clownfish‑16SrRNA‑F，其包含20个碱基：AAGGGGAGGCAAGTCGTAAC，位于12S rRNA基因上，重链引物为Clownfish‑16SrRNA‑R，包含20个碱基：TGTGTAAAGGGCTTAGGTCT，位于tRNA‑Leu基因上，本发明还提出小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物的扩增方法，通过设定反应体系和反应条件获得扩增引物，可以高效特异性地扩增多种小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列及tRNA‑Val基因全序列，能应用于小丑鱼不同分类阶元系统进化和分类研究。

技术领域

本发明涉及渔业资源生物学领域，尤其是小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物及其扩增方法

背景技术

鱼类线粒体基因组由13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因(12SrRNA及16S rRNA)共37个编码基因及一段主要的非编码区(控制区)组成，具有结构简单、拷贝数多、严格的母系遗传、几乎不发生重组、编码效率高、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点。由于鱼类线粒体基因组所具有的这些特点，使其成为鱼类分子群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域的重要分子标记。其中16S rRNA基因作为编码线粒体中一种核糖体RNA的基因，未受密码子编码的选择压力影响，大部分区域发生的变异为中性突变，加之16S rRNA基因进化速度适中，序列更加接近于祖先基因组序列、具有潜在的通用性、在不同区段具有不同的进化速率等特点，因此常被应用于不同阶元物种的系统进化和分类研究。另外，二级结构包含的茎环结构在每个物种间有所差异，因此二级结构的比对以及预测对于研究物种间的系统发生关系也有着极为重要的意义。

小丑鱼是对雀鲷科海葵鱼亚科鱼类的俗称，目前全世界共发现28种，是当前海水观赏鱼销量较大的种类。近年来，以小丑鱼为代表的海水观赏鱼繁育技术有了较大突破，世界上已能成功繁育14种小丑鱼，进行商业化生产的有近10种。在国内，关于小丑鱼的研究还处于起始阶段，主要集中于生活习性、人工繁殖及幼体培育、胚胎发育、光照与体色等方面，而分子遗传方面的研究较少。海葵鱼亚科种类的鉴定主要依赖形态学方法，以体色和条带数目为主要特征。然而不同种类的小丑鱼形态差别不大，同一种类常因外在因素的变化或成长阶段的不同，体表颜色和花纹也会随之改变，给传统分类学鉴定增加难度。因此，有必要用分子遗传学手段对小丑鱼的遗传结构进行进一步阐述。目前国内外有一些以小丑鱼线粒体16S rRNA基因作为分子标记的研究，但仍没有扩增小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列的通用引物报道。因此设计新的针对小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列的通用引物，对于有效获得绝大多数小丑鱼类线粒体16S rRNA基因全序列是十分必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物及其扩增方法，可以高效特异性地扩增多种小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列及tRNA-Val基因全序列，能应用于小丑鱼不同分类阶元系统进化和分类研究。

为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是：

小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物，所述扩增引物包括轻链引物和重链引物：

所述轻链引物为Clownfish-16SrRNA-F，包括20个碱基，位于12S rRNA基因上；

所述重链引物为Clownfish-16SrRNA-R，包括20个碱基，位于tRNA-Leu基因上。

进一步的，所述轻链引物的碱基序列为AAGGGGAGGCAAGTCGTAAC。

进一步的，所述重链引物的碱基序列为TGTGTAAAGGGCTTAGGTCT。

本发明在还延伸出小丑鱼线粒体16S rRNA基因全序列扩增引物的扩增方法，所述扩增方法包括：