[发明专利]一种干细胞皮肤粘贴片及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种干细胞皮肤粘贴片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

S1、从皮肤组织块上分离获取皮肤干细胞；取新鲜皮肤组织块，依次用75％乙醇、3％双抗的PBS浸洗；然后将组织切碎，加入消化酶混合液孵育酶解得酶解液I，然后再加入0.25％胰酶继续孵育酶解得酶解液II，之后加入DNase I继续孵育得酶解液III；终止消化后，获得单细胞悬液，过滤细胞悬液，取滤过的细胞，用带血清的DMEM重悬洗涤一次，然后用皮肤干细胞培养基重悬；

S2、皮肤干细胞的培养传代扩增；

S3、将传代扩增获得皮肤干细胞铺设于细胞膜片上孵育获得细胞粘贴片。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体方法为：

所述组织与消化酶混合液的质量体积比为1g：10-20ml。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述消化酶混合液为裂解酶和胶原酶的混合溶液，所述裂解酶和胶原酶的浓度均为2.0～5.0mg/L；

所述消化酶混合液孵育酶解的具体条件为：在30～40℃处理0.8～1.5h。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述消化酶混合液孵育酶解的具体条件为：在37℃处理0.8～1.5h。

5.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述消化酶混合液孵育酶解的具体条件为：在30～40℃处理1h。

6.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述消化酶混合液孵育酶解的具体条件为：在37℃处理1h。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液I与0.25％胰酶的体积比为1:2～4；采用0.25％胰酶孵育时间为20～60分钟。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液I与0.25％胰酶的体积比为1:3；采用0.25％胰酶孵育时间为20～60分钟。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液I与0.25％胰酶的体积比为1:2～4；采用0.25％胰酶孵育时间为30分钟。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液I与0.25％胰酶的体积比为1:3；采用0.25％胰酶孵育时间为30分钟。

11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液II与DNase I的体积比为0.5～2:1000；采用DNase I孵育时间为3～6分钟。

12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液II与DNase I的体积比为1:1000；采用DNase I孵育时间为3～6分钟。

13.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液II与DNase I的体积比为0.5～2:1000；采用DNase I孵育时间为5分钟。

14.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液II与DNase I的体积比为1:1000；采用DNase I孵育时间为5分钟。

15.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述过滤方式具体为：采用100微米孔径滤网过滤细胞悬液。

16.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体方法为：

将分离获得的皮肤干细胞进行细胞培养，细胞长满后采用胰酶消化，并以1:3-10倍进行传代培养，传代后细胞长满后继续使用胰酶消化细胞。