[发明专利]一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法

权利要求书

1.一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶材料包含人脐带间充质干细胞外泌体，纳米羟基磷灰石(nHAP)，透明质酸-己二酸二酰肼衍生物(HA-ADH)和主链具有醛基的海藻酸衍生物(ALG-CHO)。

2.根据权利要求1所述的一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，其组成成分中，nHAP终浓度为5％(w/v)，HA-ADH终浓度为5％(w/v)，ALG-CHO终浓度为5％(w/v)，所含外泌体浓度为150ug/ml。

3.根据权利要求1所述的一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，其制备方法包括以下步骤。

(1)脐带间充质干细胞的分离培养；

(2)脐带间充质干细胞的成骨诱导：取培养至第三代步骤(1)中的细胞继续培养，当细胞密度达70％时换用成骨诱导培养基继续培养。

(3)外泌体提取：取步骤(2)中成骨诱导2天后的细胞培养上清，在4℃条件下300g离心10min，2000g离心10min，10000g离心30min去除死细胞和细胞碎片，随后用0.22um滤膜过滤培养基，进一步在4℃，100000g条件下离心2小时。所得白色沉淀即为外泌体，将其溶解至PBS中于-80℃冰箱中保存。

(4)nHAP制备：将硝酸钙溶解在去离子水中，加入柠檬酸钠，搅拌至完全溶解后用氨水调节溶液pH值，得到溶液A；将磷酸氢二铵溶解在去离子水中得到溶液B；随后启动超重力旋转填充床(RPB)，调节转速，将A、B两种溶液分别输送到RPB中反应生成的浆料产物经过离心、洗涤、真空干燥后得到nHAP。

(5)HA-ADH制备：将透明质酸溶于去离子水中，溶解后加入己二酸二酰肼(ADH)并搅拌均匀，随后用HCl调节溶液pH，室温反应12h后，用去离子水透析，冷冻干燥得HA-ADH。

(6)ALG-CHO制备：将海藻酸钠溶解到去离子水中，将高碘酸钠溶解于去离子水中，室温下反应24h，随后添加乙二醇终止反应，经过透析、冷冻干燥得到LG-CHO。

(7)复合水凝胶制备：称取nHAP分散于PBS溶液中，并加入HA-ADH至完全溶解，得到溶液1；称取ALG-CHO溶解于含有外泌体的PBS溶液中得到溶液2；随后将两种溶液装入注射枪内，注射到缺损部位使用。

4.根据权利要求1所述的用于骨缺损修复的含人脐带间充质干细胞外泌体复合水凝胶，其特征在于，所述水凝胶用于治疗颅颌面及其他部位的骨缺损。