[发明专利]一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法

说明书

本发明涉及一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法，属于生物医学工程技术领域。所述水凝胶材料是含有包含人脐带间充质干细胞外泌体，纳米羟基磷灰石，透明质酸‑己二酸二酰肼衍生物和主链具有醛基的海藻酸衍生物。其制备方法包含人脐带间充质细胞的分离、外泌体的提取、纳米羟基磷灰石制备、海藻酸钠透明质酸衍生物制备及复合水凝胶制备等步骤。本发明为骨缺损治疗提供了一种新的修复方法，具有广阔的应用前景和理想的修复效果。

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其是涉及一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法。

背景技术

骨缺损修复是骨科领域研究的热点问题。临床上即使是常见的骨折，由于骨再生不良，大约有2％-10％的骨折可能进展为骨不连。而骨科临床医生也常常遇到诸如骨折、骨感染、骨肿瘤切除等原因造成的骨缺损的问题。此外，肥胖、糖尿病等导致骨骼肌肉疾病的增多和骨再生的减少，老龄骨质疏松患者骨折风险较高而骨再生能力不足。因此，如何促进骨骼再生，仍然是临床医生面临的主要挑战。

以间充质干细胞为基础的骨组织工程技术为临床骨缺损再生修复带来了新希望。近期研究表明，干细胞衍生外泌体与干细胞具有相似的生物学效应，可以作为干细胞的替代物应用于骨组织修复，从而避免因直接使用干细胞而导致的突变致瘤、免疫排斥等诸多风险。

目前利用外泌体来修复骨缺损的研究中，主要是将外泌体通过注射的方式来发挥作用，但是这种方法会导致外泌体在体内很快被清除，而骨修复又是一个长周期过程。因此，如何调控外泌体在骨缺损处的释放速率和释放周期，使其与新骨生长周期良好匹配，提高外泌体的生物利用度，从而达到最优的疗效是利用外泌体进行骨修复需要解决的关键问题。

发明内容

针对以上问题，本申请人提供了一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶。本发明选用海藻酸钠-透明质酸水凝胶作为载体，包裹外泌体注射到骨缺损部位，实现外泌体的控释与缓释，同时加入了纳米羟基磷灰石，从而进一步加强材料的机械性能和骨传导性。

本发明的技术方案如下：

一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶材料包含人脐带间充质干细胞外泌体，纳米羟基磷灰石(nHAP)，透明质酸-己二酸二酰肼衍生物(HA-ADH)和主链具有醛基的海藻酸衍生物(ALG-CHO)。

进一步地，水凝胶中nHAP终浓度为5％(w/v)，HA-ADH终浓度为5％(w/v)，ALG-CHO终浓度为5％(w/v)，所含外泌体浓度为150ug/ml。

进一步地，其制备方法有以下步骤：

(1)脐带间充质干细胞的分离培养；

(2)脐带间充质干细胞的成骨诱导：取培养至第三代步骤(1)中的细胞继续培养，当细胞密度达70％时换用成骨诱导培养基继续培养。

(3)外泌体提取：取步骤(2)中成骨诱导2天后的细胞培养上清，在4℃条件下300g离心10min，2000g离心10min，10000g离心30min去除死细胞和细胞碎片，随后用0.22um滤膜过滤培养基，进一步在4℃，100000g条件下离心2小时。所得白色沉淀即为外泌体，将其溶解至PBS中于-80℃冰箱中保存。

(4)nHAP制备：将硝酸钙溶解在去离子水中，加入柠檬酸钠，搅拌至完全溶解后用氨水调节溶液pH值，得到溶液A；将磷酸氢二铵溶解在去离子水中得到溶液B；随后启动超重力旋转填充床(RPB)，调节转速，将A、B两种溶液分别输送到RPB中反应生成的浆料产物经过离心、洗涤、真空干燥后得到nHAP。