[发明专利]一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法

权利要求书

1.一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，该方法包括分离菌株、血清型鉴定、溶菌质粒的构建、菌蜕的制备及灭活处理步骤；其中，在溶菌质粒的构建时使用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建；灭活处理时采用β-丙内酯。

2.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建的方法为：将E基因连接至pUC57载体，得到pUC57-E；再用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切重组质粒pUC57-E和表达载体pBV221，利用T4 DNA连接酶将E基因片段连接至载体pBV221，连接产物转化至DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆并扩大培养，从菌液中提取质粒并进行双酶切鉴定和测序鉴定，构建pBV221-E溶菌质粒。

3.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的菌蜕的制备方法为：将构建的pBV221-E溶菌质粒转化至上述分离菌株，用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，通过筛选鉴定得到pBV221-E/D阳性克隆，将pBV221-E/D菌液在28℃-35℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5，将OD₆₀₀为0.5的菌液置于40℃-42℃诱导表达，每隔30min取样测量菌液的OD₆₀₀值；诱导表达培养至pBV221-E/D菌液的OD₆₀₀值不变时，即为菌蜕的菌液。

4.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，采用β-丙内酯两次对制备的菌蜕进行灭活处理。

5.根据权利要求4所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的灭活处理步骤为：将制备得到的菌蜕的菌液中加入β-丙内酯至终浓度为0.025％，静置作用后，离心，收集沉淀；先在沉淀中加与原始菌液等体积的PBS溶液重悬，离心并收集沉淀；再在前述沉淀中加原始菌液1/2体积的PBS溶液重悬，离心并收集沉淀；最后再在前述沉淀中加原始菌液1/5体积的PBS溶液重悬，然后加入β-丙内酯至终浓度为0.05％，再次静置作用，得到O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕。

6.根据权利要求5所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的第一次静置作用的反应条件为37～42℃下作用1～2h，再次静置作用的反应条件为37～42℃作用2～3h。

7.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的血清型鉴定是通过玻板凝集试验和/或试管凝集试验对鸭致病性大肠杆菌进行血清型鉴定，分离鉴定出血清型为O24的大肠杆菌菌株。

8.根据权利要求7所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的血清型鉴定的具体步骤为：将鸭致病性大肠杆菌菌株接种于2mL LB液体培养基，先在37℃下150～200rpm震荡培养10-20h，再在121℃、103.4kPa高压下培养2h，然后高压后的菌液离心弃上清液，用400μL 0.5％的石炭酸生理盐水重悬菌体并制成浓稠悬液，作为大肠杆菌菌体抗原；取7μL大肠杆菌菌体抗原与2μL大肠杆菌O抗原血清置于玻板上混匀至出现凝集，确定血清型。

9.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的分离菌株包括麦康凯培养基筛选、生化鉴定和PCR检测步骤。

10.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的pBV221载体是氨苄青霉素抗性的pBV221载体。