[发明专利]一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法

说明书

本发明公开了一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，该方法包括分离菌株、血清型鉴定、溶菌质粒的构建、菌蜕的制备及灭活处理步骤；其中，在溶菌质粒的构建时使用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建；灭活处理时采用β‑丙内酯。制备过程简单且无需使用诱导剂、甲醛和冷冻干燥设备，降低成本，填补了行业中O24型大肠杆菌菌蜕制备领域的空白，解决了需要加入诱导剂IPTG，成本较高，步骤繁琐，甲醛灭活菌蜕中残留甲醛影响动物健康的技术问题。

技术领域

本发明涉及菌蜕领域，更具体地，涉及一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法。

背景技术

菌蜕是利用裂解基因制成的革兰氏阴性细菌的菌壳，是不包含核酸及细胞质等细胞内容物的细菌空壳，这种细菌空壳保持了原细菌完整的内外膜结构，包括膜表面的各种抗原成分和一些粘附特性，因此可以刺激机体产生良好的体液、细胞和黏膜免疫，被认为是一种新型的候选疫苗。在上世纪80年代奥地利学者W.Lubitz等首先研发出这种独特的灭活疫苗：革兰氏阴性菌表达噬菌体的裂解蛋白E后，革兰氏阴性菌在该裂解蛋白和渗透压的作用下在细胞膜上形成一个跨膜通道结构，细菌内的细胞质内容物通过这个通道排出，这种灭活方式是非变性的，所以细菌表面结构的化学性质和物理性质不会发生任何改变，制备的菌蜕使细菌表面的各种免疫黏附成分和抗原分子都完整地保存下来。研究发现，菌蜕在不同种的血清型之间能诱导交叉免疫保护作用，在牛、兔和禽类等动物的免疫结果也表明，菌蜕免疫动物可以起到很好的免疫保护作用。同时，菌蜕具有免疫佐剂性质以及递送系统功能，可以将其它抗原锚定于菌蜕表面制备成重组疫苗，或者将药物装载于菌蜕用于疾病的靶向治疗。菌蜕疫苗和载体还具备制备工艺简单，保存与运输方便等优势，因此有较为广阔的应用前景。

目前，对牛、猪、鸡和渔用革兰阴性菌菌蜕疫苗研制的报道较多，但对水禽致病性大肠杆菌菌蜕疫苗制备的报道较少。但是，这些报道的水禽致病性大肠杆菌菌蜕在制备过程中存在以下缺点：(1)所用的抗性的原核表达载体通常为pET系列载体，在溶菌质粒构建时，需要加入诱导剂IPTG，成本较高，步骤繁琐；(2)灭活通常采用甲醛灭活的方法或冻干灭活的方法，但是，甲醛毒性较强，对动物健康危害较大，而冻干法需要专业的冻干设备且耗时较长；(3)采用的大肠杆菌菌株通常为血清型O78菌株，因为不同血清型的菌蜕之间没有交叉保护力，因此只能用于O78菌株感染的免疫预防。

发明内容

本发明的目的是针对上述的不足，提出一种鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法。本发明采用O24型大肠杆菌菌株和pBV221载体进行溶菌质粒的构建和菌蜕的制备，并使用可快速水解、无毒的β-丙内脂对菌蜕进行灭活，得到O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕。制备过程简单且无需使用诱导剂、甲醛和冷冻干燥设备，降低成本，填补了行业中O24型大肠杆菌菌蜕制备领域的空白，解决了其它载体需要加入诱导剂IPTG，成本较高，步骤繁琐，甲醛灭活菌蜕中残留甲醛影响动物健康的技术问题。本发明制备得到的O24 型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的裂解率高达99.99％，血清抗体水平显著提高，为进一步研制禽致病性大肠杆菌菌蜕疫苗和可用于禽类细菌病、病毒病和寄生虫病的新型疫苗载体或佐剂奠定了研究基础。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，该方法包括分离菌株、血清型鉴定、溶菌质粒的构建、菌蜕的制备及灭活处理步骤；其中，在溶菌质粒的构建时使用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建；灭活处理时采用β-丙内酯。

所述的用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建的方法为：将E基因连接至pUC57载体，得到pUC57-E；再用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切重组质粒pUC57-E和表达载体pBV221，利用T4DNA连接酶将E基因片段连接至载体pBV221，连接产物转化至DH5 α感受态细胞，在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆并扩大培养，从菌液中提取质粒并进行双酶切鉴定和测序鉴定，构建pBV221-E溶菌质粒。

所述的E基因序列为：