[发明专利]一种基因工程菌及以D;L-扁桃酸为底物制备L-苯甘氨酸的方法在审
| 申请号： | 201910625218.9 | 申请日： | 2019-07-11 |
| 公开（公告）号： | CN110452920A | 公开（公告）日： | 2019-11-15 |
| 发明（设计）人： | 唐存多;史红玲;姚伦广;阚云超;焦铸锦;刘宗才;贾园园;李祥 | 申请（专利权）人： | 南阳师范学院 |
| 主分类号： | C12N15/61 | 分类号： | C12N15/61;C12N15/53;C12N1/21;C12N15/70;C12P13/04;C12R1/19 |
| 代理公司： | 41134 郑州铭晟知识产权代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 张鹏<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
| 地址： | 473061河南*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因工程菌 扁桃酸 密码子优化 苯甘氨 制备 生物工程技术领域 扁桃酸脱氢酶 亮氨酸脱氢酶 催化效率 辅助因子 表达量 共表达 消旋酶 底物 催化 | ||
1.一种编码扁桃酸消旋酶的基因ArMR，其特征在于：所述ArMR基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.一种编码D-扁桃酸脱氢酶的基因LhDMDH，其特征在于：所述LhDMDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种编码L-亮氨酸脱氢酶的基因EsLeuDH，其特征在于：所述EsLeuDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求1-3中任意一项或任意两项或三项所述的基因。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求1所述的ArMR基因、如权利要求2所述的LhDMDH基因和如权利要求3所述的EsLeuDH基因。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、构建重组质粒pET28a-ArMR，将ArMR基因连接至pET28a质粒，获得重组质粒pET28a-ArMR，转化BL21感受态细胞，经卡拉霉素筛选、菌液PCR检测和测序鉴定，获得工程菌BL21/pET28a-ArMR；
步骤二、构建重组质粒pACYCDuet-LhDMDH-EsLeuDH，将LhDMDH基因和EsLeuDH基因分别连接至pACYCDuet质粒，获得重组质粒pACYCDuet-LhDMDH-EsLeuDH；
步骤三、重组质粒转化入宿主细胞：将所述步骤二制得的重组质粒pACYCDuet-LhDMDH-EsLeuDH利用热激转化至大肠杆菌BL21/pET28a-ArMR感受态细胞中，添加0.4mL LB液体培养基在37℃、220rpm下孵育1h后，涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB固体平板上，在37℃下培养12～16h，得到单克隆菌落；
步骤四、重组菌的筛选与鉴定：挑取所述单克隆菌落至4mL含有50μg/mL卡拉霉素和氯霉素双抗的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下培养1～4h，进行菌液PCR检测和测序鉴定，确认获得所述基因工程菌BL21/pET28a-ArMR：pACYCDuet-LhDMDH-EsLeuDH。
7.一种以D,L-扁桃酸为底物制备L-苯甘氨酸的方法，其特征在于，在反应体系中加入如权利要求4或5所述的基因工程菌。
8.根据权利要求7所述的以D,L-扁桃酸为底物制备L-苯甘氨酸的方法，其特征在于，反应体系中所述D,L-扁桃酸的终浓度为1-100mM，NH4+的终浓度为1～500mM，控制反应液pH在6～12，反应温度5～50℃。
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