[发明专利]一种基因工程菌及以D;L-扁桃酸为底物制备L-苯甘氨酸的方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因工程菌及以D,L‑扁桃酸为底物制备L‑苯甘氨酸的方法。该基因工程菌包含密码子优化后的扁桃酸消旋酶、D‑扁桃酸脱氢酶和L‑亮氨酸脱氢酶，3种酶可共表达，且表达量明显大于密码子优化前，将该基因工程菌用于催化D,L‑扁桃酸制备L‑苯甘氨酸时，无需添加辅助因子，且转化率和催化效率高。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因工程菌及以D,L-扁桃酸为底物制备L-苯甘氨酸的方法。

背景技术

L-苯甘氨酸(L-Phenylglycine)又名L-苯基甘氨酸，属于非天然芳香族α-氨基酸，是医药工业中重要的手性砌块和原料。L-苯甘氨酸及其衍生物是合成紫杉醇、氨苄青霉素、头孢氨苄等β-内酰胺类抗生素的关键手性中间体，其中L-邻氯苯甘氨酸更是合成重磅炸弹药物——氯吡格雷的重要中间体。随着化工技术的不断发展，化学合成L-苯甘氨酸的工艺已非常成熟。但是，传统的化学合成中会用到剧毒的氰化物或者强碱，对环境极不友好。此外，化学合成L-苯甘氨酸的对映选择性和产率都较低，增大了后续手性拆分的成本。生物合成与传统的化学合成相比，具有选择性强、反应条件温和、环境友好及对设备要求低等优势，随着环境问题日益突出，绿色、环保的生物合成更受广大研究者的关注。随后也出现了一些利用苯海因酶转化法、D-苯甘氨酸氨基转移酶法和氨基酸脱氢酶法等生物合成苯甘氨酸的报道。然而，它们仍存在一定的缺陷，例如需要硫酸的辅助、催化活性低或需要额外的辅酶循环系统等。因此，目前亟待开发一条转化效率高、对映选择性好、成本低廉并且环境友好的L-苯甘氨酸制备路线。

CN 108504642公开了一种基因工程复合菌及其在苯乙酮酸生物合成中的应用，该基因工程复合菌包含编码L-乳酸脱氢酶、D-扁桃酸消旋酶和D-扁桃酸脱氢酶的基因，可将外消旋扁桃酸转化为苯乙酮酸(苯乙酮酸可作为生产L-苯甘氨酸的底物)。具体的反应体系为：将外消旋扁桃酸加入上述基因工程复合菌的发酵液中，使扁桃酸的终浓度为1-100mM，维持反应温度为4-50℃，采用HPLC监测反应进程，当24h时，外消旋扁桃酸的转化率可达90％以上。其中L-乳酸脱氢酶主要起加快NAD⁺和NADH循环的作用。

CN 106119272A公开了一种高效联产L-苯甘氨酸及葡萄糖酸的策略，可采用酶法或全细胞法制备L-苯甘氨酸，其中，全细胞法具体为：将L-亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共同在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌，利用pH8.0的100mM PB缓冲液洗涤细胞然后以PB缓冲液等体积悬浮，再加入5％的甘油和4％曲拉通的情况下，投入500mM苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH₄Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L-苯甘氨酸和葡萄糖酸。实施例11进一步公开了当采用全细胞法制备L-苯甘氨酸时，以500mM苯甲酰甲酸为底物制备得到了45.8g/L L-苯甘氨酸，转化率为60.6％，转化率低。

现有技术中采用生物法，以外消旋扁桃酸为底物制备L-苯甘氨酸时，存在底物转化率低、菌体内NAD⁺和NADH循环效率差的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种编码扁桃酸消旋酶的基因ArMR，所述ArMR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该ArMR基因是经密码子优化得到的，相对于优化前，其表达水平明显提高，有助于提高催化D,L-扁桃酸的效率。

本发明的目的之二在于，提供一种编码D-扁桃酸脱氢酶的基因LhDMDH，所述LhDMDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该LhDMDH基因是经密码子优化得到的，相对于优化前，其表达水平明显提高。

本发明的目的之三在于，提供一种编码L-亮氨酸脱氢酶的基因EsLeuDH，所述EsLeuDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。该EsLeuDH基因是经密码子优化得到的，相对于优化前，其表达水平明显提高。